RegⅠ在胃泌素促胃癌細(xì)胞增殖通路中的作用.pdf

1、外源性胃泌素,如G17、甘氨酸衍生性G17、前胃泌素和內(nèi)源性胃泌素均可促進(jìn)胃腸癌細(xì)胞的增殖。除了在胃腺癌的發(fā)展中,胃泌素也在其他一些類型腫瘤(尤其是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤)的發(fā)病機(jī)制里起了關(guān)鍵的作用。因此,越來越多的證據(jù)證明胃泌素不僅影響腫瘤的發(fā)展,它也將可能成為潛在的各種胃瘤樣病變的治療靶點。
　　 RegⅠ是Reg基因家族的一員,是胃泌素的一個轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因。RegⅠ既存在于正常胃粘膜細(xì)胞,也存在于胃腺癌癌組織細(xì)胞內(nèi)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)

2、,胃癌組織RegⅠ蛋白的表達(dá)高于正常胃粘膜組織。利用Northern blot技術(shù)、原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)分析,RegⅠ基因在胃腺癌的陽性表達(dá)占35％。浸潤性胃癌的癌組織較局限性癌的癌組織RegⅠ的表達(dá)水平高,而且患者預(yù)后調(diào)查中發(fā)現(xiàn)RegⅠ陽性表達(dá)的患者差于RegⅠ陰性患者。
　　 低分化型胃癌RegⅠ蛋白表達(dá)比高分化型胃癌表達(dá)高,浸潤型胃癌RegⅠ蛋白比原位型胃癌表達(dá)高,RegⅠ基因的表達(dá)與胃腺癌的浸潤生長及分化有著密切關(guān)

3、系。
　　 胃泌素促胃癌細(xì)胞增殖的過程中,RegⅠ具有什么樣的作用?RegⅠ主要在腸嗜鉻樣(enterochromaffin-lik celle,ECL)細(xì)胞中表達(dá)。RegⅠ在ECL細(xì)胞中的分泌,其中一方面是由于胃泌素的刺激。慢性高胃泌素血癥患者,Reg蛋白表達(dá)增加并伴隨了胃粘膜細(xì)胞的增殖。胃粘膜細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出對胃泌素劑量和時間依賴性。胃泌素對胃黏膜細(xì)胞的生長并無直接的生長刺激效應(yīng),而是通過刺激Reg蛋白表達(dá)來刺激胃粘膜細(xì)胞的

4、生長。近幾年人們開始對其在胃腸道組織內(nèi)的表達(dá)及功能展開研究,RegⅠ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被重視,但其作用機(jī)制目前仍在進(jìn)一步研究中。
　　 本研究構(gòu)建了3個PegⅠ-shRNA表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901,G418篩選；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)篩選建立了兩個RegⅠ表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞系(BGC-823和SGC-7901)。應(yīng)用MTT技術(shù)檢測胃泌素和RegⅠ-shRNA表達(dá)載體對胃癌細(xì)胞系BGC-8

5、23和SGC-7901增殖的效應(yīng),探討RegⅠ在胃泌素促胃癌細(xì)胞增殖通路的作用。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建PegⅠ-shRNA表達(dá)載體根據(jù)RegⅠ基因在GenBank中所查到的mRNA序列,通過在線設(shè)計和同源性比較確定3條靶向RegⅠ的siRNA序列,并合成互補(bǔ)性發(fā)卡樣寡核苷酸。退火形成雙鏈后,插入pSUPER-EGFP-Ⅰ質(zhì)粒,構(gòu)建3個RegⅠ-shRNA表達(dá)載體:pSUPER-EGFP-REG/14、pSUPER

6、-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3。HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切及序列分析鑒定。
　　 2.梯度濃度胃泌素對胃癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)應(yīng)用10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6mol/L和10-5 mol/L的胃泌素G17孵育胃癌細(xì)胞系SGC-7901及BGC-823,分別于24h、48h和72h后,應(yīng)用MTT技術(shù)檢測胃泌素對胃癌細(xì)胞增殖效應(yīng),篩選出胃泌素對細(xì)胞增殖最有效的作用濃度和作用時間。

7、>　　 3.轉(zhuǎn)染及篩選轉(zhuǎn)染前胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901的培養(yǎng)體系采用無抗生素培養(yǎng)基。各質(zhì)粒提取均采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。分實驗組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3)、實驗對照組質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSUPER-EGFP-Ⅰ)和對照組(無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染,G418選擇性篩選近3周。RT-PCR技

8、術(shù)檢測RegⅠ mRNA水平,建立RegⅠ基因表達(dá)抑制的BGC-823細(xì)胞系和SGC-7901細(xì)胞系。
　　 4.胃泌素孵育對RegⅠ基因表達(dá)抑制細(xì)胞系的增殖效應(yīng)采用最佳胃泌素孵育的濃度和時間段孵育RegⅠ基因表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞系和SGC-7901細(xì)胞系,應(yīng)用MTT技術(shù)比較孵育前后胃癌細(xì)胞增殖變化。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)處理所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)

9、,采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.RegⅠ-shRNA表達(dá)載體構(gòu)建酶切及測序鑒定,插入片段正確,3個shRNA表達(dá)載體,pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3構(gòu)建成功。
　　 2.胃泌素孵育最佳濃度及時間 MTT結(jié)果顯示,胃泌素對胃癌細(xì)胞的促增殖效應(yīng)具有濃度和時間依賴性；濃度10-5 mol

10、/L,作用時間72h,胃泌素G17對胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901的促增殖效應(yīng)最佳。
　　 3.RT-PCR結(jié)果 RegⅠ和β-aetin擴(kuò)增的片段分別為281 bp和389 bp。pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2、pSUPER-EGFP-REG/3、pSUPER-EGFP-Ⅰ和對照組的RegⅠ/β-actin灰度比值的均值分別為0.288±0.067、0.947±0.048、0

11、.873±0.084、0.972±1:0.016和0.984±0.013(BGC-823),0.400±0.152、0.9934±0.021、0.913±0.034、0.968±0.014和0.972±0.014(SGC-7901)。轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-REG/1的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞RegⅠ mRNA水平均明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP-REG/1表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞系為RegⅠ基

12、因表達(dá)抑制細(xì)胞系。
　　 4.MTT結(jié)果
　　 胃癌細(xì)胞系BGC-823
　　 RegⅠ基因表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞系BGC-823的增殖效率(0.779±0.015)明顯低于對照組胃癌細(xì)胞BGC-823(0.9764±0.010)(P<0.05)。胃泌素孵育后,胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖效率(0.924±0.015)明顯增加(P<0.05)；而RegⅠ基因表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞系增殖效率(0.789±0.223)與孵育前

13、比較無明顯改變(P>0.05)。
　　 胃癌細(xì)胞系SGC-7901
　　 RegⅠ基因表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901的增殖效率(0.773±0.008)明顯低于對照組胃癌細(xì)胞SGC-7901(0.915±0.028)(P<0.05)。胃泌素孵育后,胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖效率(0.975±0.009)明顯增加(P<0.05)；而RegⅠ基因表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞系增殖效率(0.776±0.006)與孵育前比較無明顯