CXCR4-CXCR7在SDF-1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、遷移中的作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、目的：(1)建立一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowme senchymalstem cells,MSCs)的體外分離純化、擴增的方法,探討MSCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可行性。(2)體外探討CXCR4/CXCR7在SDF-1誘導(dǎo)MSCs增殖和遷移中的作用及與磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)/核因子-κB(NuclearfactorkappaB,NF-κB)信號通路的關(guān)系,為后期整體動

2、物實驗提供實驗依據(jù)。
　　方法：(1)全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)、鑒定MSCs,利用血小板源性生長因子-BB(Platelet-derivedgrowthfactor-BB,PDGF-BB)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)進行聯(lián)合誘導(dǎo),誘導(dǎo)期間觀察細(xì)胞形態(tài)變化,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,

3、α-SMA)、鈣調(diào)蛋白(calponin)、平滑肌鈣結(jié)合相關(guān)蛋白(smoothmuscle22α,SM22α)和平滑肌肌球蛋白重鏈(Smoothmuscle-myosinheavychain,SM-MHC)的表達;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測前三種標(biāo)記物蛋白表達。(2)RT-PCR檢測不同濃度SDF-1誘導(dǎo)前后MSCs的CXCR4和CXCR7的表達。以PI3K抑制劑渥曼青霉素(Wortmanin)、NF-κB抑制劑二硫代氨基吡咯烷(PDTC)、CX

4、CR4抗體(anti-CXCR4)和CXCR7抗體(anti-CXCR7)作為工具藥,四甲基偶氮唑藍(MTT)微量比色法和Transwell遷移實驗分別檢測MSCs的增殖和跨膜遷移。
　　結(jié)果：(1)①MSCs接種24~48h后,貼壁細(xì)胞多為圓形、多角形、梭形,傳至第3代呈現(xiàn)形態(tài)均一的長梭形細(xì)胞;P3代MSCs強表達CD44,低表達CD106,不表達CD11b、CD45,具有成脂、成骨等多向分化能力。②MSCs經(jīng)50ng/mlPD

5、GF-BB和5ng/mlTGF-β1聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)明顯改變,呈細(xì)長梭形,可重疊生長,局部融合后可呈平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”狀;RT-PCR檢測結(jié)果顯示MSCs誘導(dǎo)前后均表達a-SMA、SM22a、Calponin和SM-MHC,但誘導(dǎo)后表達明顯增強(P<0.01);免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果同RT-PCR基本一致。(2)①MSCs同時表達CXCR4和CXCR7,SDF-1誘導(dǎo)后CXCR4表達增高(P<0.01),而CXCR7表達無明顯變

6、化(P>0.05)。②SDF-1組MSCs的增殖和跨膜遷移較正常對照組顯著提高(P<0.01),且具有一定濃度依賴性。③SDF-1+Wortmanin組(E)、SDF-1+Wortmanin+PDTC組(F)、SDF-1+anti-CXCR4組(G)和SDF-1+anti-CXCR7組(H)細(xì)胞的增殖較同等劑量SDF-1組顯著降低(P<0.01),而同型抗體IgG組(I)與同等劑量SDF-1組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),另外,SD

7、F-1+Wortmanin+PDTC組細(xì)胞的增殖亦低于SDF-1+Wortmanin組(P<0.05)。④SDF-1+Wortmanin組(E)、SDF-1+Wortmanin+PDTC組(F)和SDF-1+anti-CXCR4組(G)細(xì)胞的遷移較同等劑量SDF-1組顯著降低(P<0.01),而同型抗體IgG組(I)和SDF-1+anti-CXCR7組(H)與同等劑量SDF-1組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),另外,SDF-1+Wor

8、tmanin+PDTC組細(xì)胞的遷移亦低于SDF-1+Wortmanin組(P<0.01)。
　　結(jié)論：(1)①全骨髓貼壁培養(yǎng)法及其擴增后可獲得大量純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞;②大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在能分化為平滑肌細(xì)胞的前體細(xì)胞——平滑肌祖細(xì)胞,并且可在PDGF-BB和TGF-β1聯(lián)合誘導(dǎo)下分化為平滑肌細(xì)胞。(2)①SDF-1可能通過上調(diào)CXCR4的表達并與之結(jié)合在促進MSCs的體外增殖和遷移中起關(guān)鍵作用,而CXCR7對增殖有一定作