肝干細(xì)胞在膽汁淤積性肝硬化中分化及高表達(dá)CXCR4-CXCR7對肝干細(xì)胞增殖、遷移、抗氧化應(yīng)激損傷的研究.pdf

1、目的：
　　探究膽汁淤積性肝硬化患兒肝臟中肝干細(xì)胞的動(dòng)員，建立及評價(jià)膽汁淤積性肝硬化小鼠模型，經(jīng)脾臟體內(nèi)移植肝干細(xì)胞HP14-19，探討HP14-19在膽汁淤積性肝硬化中的分化。重組腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7誘導(dǎo)肝干細(xì)胞，探討SDF-1/CXCR4和SDF-1/CXCR7對HP14-19增殖、遷移和抗氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法：
　　1.隨機(jī)選取我院100例BA患兒為實(shí)驗(yàn)組，20例膽總管囊腫患兒為對照

2、組，比較血清AFP水平；選取20例膽道閉鎖患兒和20例膽總管囊腫患兒肝臟組織標(biāo)本行免疫組織化學(xué)檢測卵圓細(xì)胞標(biāo)志物ov-6,c-kit的表達(dá)情況。
　　2.84只balb/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（56只）和對照組（28只），實(shí)驗(yàn)組采用腹中線小切口行膽總管結(jié)扎手術(shù)，對照組行假手術(shù)。術(shù)后觀察小鼠一般情況及肝臟大體結(jié)構(gòu)；全自動(dòng)生化分析儀檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組術(shù)后1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d血清肝臟生化指標(biāo)（TBIL、DBIL、

3、ALT、AST）；H&E染色觀察術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肝臟組織形態(tài)學(xué)改變；術(shù)后28d小鼠肝臟組織行masson染色和免疫組織化學(xué)檢測，觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組膠原纖維與a-SMA、CK-19蛋白的表達(dá)情況。
　　3.紅色熒光蛋白RFP-luc標(biāo)記HP14-19，經(jīng)脾臟體內(nèi)移植至膽汁淤積性肝硬化小鼠模型中，對照組回輸PBS，活體成像檢測HP14-19在損傷肝臟的定植情況。熒光染料PKH26標(biāo)記HP14-19，顯微鏡和檢測HP14-19在膽汁淤積性

4、肝硬化中的定植及分化情況。
　　4.重組腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7感染HP14-19細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測細(xì)胞膜上CXCR4/CXCR7受體的表達(dá);MTT法檢測細(xì)胞增殖;Transwell法檢測細(xì)胞遷移;過氧化氫(H2O2)處理細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型, MTT法檢測細(xì)胞活力;酶學(xué)法檢測LDH和SOD活性，評價(jià)CXCR4/CXCR7介導(dǎo)SDF-1誘導(dǎo)HP14-19細(xì)胞增殖、遷移和抗氧化應(yīng)激損傷

5、作用。
　　結(jié)果：
　　1.100例實(shí)驗(yàn)組患兒中有92例患兒血清AFP明顯上調(diào),而對照組患兒均在正常范圍；實(shí)驗(yàn)組患兒肝臟組織免疫組織化學(xué)染色ov-6、c-kit表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01）。
　　2.與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后一般情況較差，膽囊、膽總管擴(kuò)張，膽汁淤積；血清肝臟生化指標(biāo)顯著升高（P＜0.05），肝臟組織HE染色見肝小葉結(jié)構(gòu)改變，膽管增生；術(shù)后28d肝臟組織masson染色可見實(shí)驗(yàn)組有膠原纖維形

6、成，免疫組織化學(xué)染色a-SMA、CK-19表達(dá)明顯高于對照組（P＜0.05）。
　　3.活體成像技術(shù)和顯微鏡下顯示實(shí)驗(yàn)組HP14-19經(jīng)脾臟體內(nèi)移植后在損傷肝臟中有表達(dá)，共聚焦顯微鏡尚未觀察到表達(dá)PKH26的HP14-19表達(dá)膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK-19。
　　4.感染腺病毒Ad-CXCR4/CXCR7后, HP14-19細(xì)胞膜CXCR4/CXCR7受體水平顯著上調(diào);高表達(dá)CXCR7可增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性,而對CXCR4無顯著效

7、果;高表達(dá)CXCR4或CXCR7可顯著增強(qiáng)SDF-1誘導(dǎo)的HP14-19細(xì)胞的遷移和氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞存活率,其中，CXCR7對遷移效應(yīng)較強(qiáng);與對照組比較,高表達(dá)CXCR4或CXCR7可降低H2O2造成的細(xì)胞氧化損傷，LDH活性,增高SOD活性。
　　結(jié)論：
　　卵圓細(xì)胞存在于膽道閉鎖患兒肝臟組織中，參與肝臟損害、膽汁淤積性肝硬化等病理過程。小鼠腹中線小切口膽總管結(jié)扎手術(shù)可成功構(gòu)建膽汁淤積性肝硬化模型，肝干細(xì)胞經(jīng)脾臟體內(nèi)移