BRCA1在結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本次研究目的是尋找可能與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥相關(guān)的基因，為臨床上克服結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥提供一定的理論依據(jù)和方向。
　　我們選取了常用構(gòu)建結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞的HCT-8細(xì)胞，該細(xì)胞系的形態(tài)超微結(jié)構(gòu)及生長特性均具有惡性上皮細(xì)胞特性，在給鼠接種后所生長出的瘤塊與患者原始腫瘤組織相似。因HCT-8在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入長春新堿(Vincristine，VCR)，容易誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，所以本研究采用不同濃度的VCR來誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞耐藥，并對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行

2、研究。
　　本課題包括以下三部分:第一部分:篩選結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥相關(guān)基因;第二部分:明確BRCA1與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥、增殖和凋亡之間的關(guān)系;第三部分:BRCA1參與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的探討。
　　第一部分 篩選結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥相關(guān)基因
　　方法:
　　1.體外構(gòu)建結(jié)腸癌耐受長春新堿HCT-8細(xì)胞。
　　2.MTT方法檢測HCT-8(敏感細(xì)胞)和HCT-8/V（人結(jié)腸癌長春新堿耐藥細(xì)胞）細(xì)胞IC50。
　　3

3、.采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法檢測HCT-8和HCT-8/V細(xì)胞中LAP，SIKE1和BRCA1mRNA的表達(dá)情況。
　　4.采用Western blotting方法檢測HCT-8和HCT-8/V細(xì)胞中SIKE1和BRCA1蛋白的表達(dá)情況。
　　5.采用ELISA方法檢測HCT-8和HCT-8/V細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)情況。
　　6.利用siRNA方法抑制細(xì)胞中TGF-β1和BRCA1表達(dá)，利用MTT方法檢測細(xì)胞IC

4、50的變化。
　　結(jié)果:
　　1.IC50結(jié)果顯示，HCT-8/V對(duì)長春新堿產(chǎn)生了明顯的耐受，HCT-8/V的IC50值(151.3±4.2)是HCT-8IC50值(8.2±1.3)約18倍。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞相比，HCT-8/V細(xì)胞中LAP和SIKE1mRNA表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯的改變，BRCA1mRNA表達(dá)水平明顯升高（在HCT-8/V細(xì)胞中表達(dá)量為在HCT-8細(xì)胞中表達(dá)量的3.05倍

5、）(P＜0.05)。
　　3.Western blotting結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞相比，HCT-8/V細(xì)胞中SIKE1蛋白水平并未出現(xiàn)明顯的變化，HCT-8/V細(xì)胞中BRCA1蛋白表達(dá)水平(0.83±0.010)較HCT-8細(xì)胞中(0.41±0.05)明顯升高（P＜0.05）。
　　4.ELISA結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞TGF-β1表達(dá)量(1607ng/ml±67.473)，HCT-8/V細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)量（3

6、323.615±118.991ng/ml），HCT-8/V細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。
　　5.轉(zhuǎn)染TGF-β1siRNA并未引起HCT-8細(xì)胞IC50發(fā)生明顯的變化，而轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA可以明顯的降低HCT-8/V的IC50水平，分別為HCT-8/V NC siRNA Treated組為1.055ng/mL，HCT-8/V BRCA1siRNA Treated組為0.178ng/mL（P＜0.05）

7、。
　　結(jié)論:
　　BRCA1基因可能參與了結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8耐受長春新堿。
　　第二部分 BRCA1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥、增殖和凋亡的影響
　　方法:
　　1.利用免疫組織化學(xué)的方法檢測了長春新堿化療敏感和化療不敏感患者腫瘤組織中BRCA1蛋白的表達(dá)。
　　2.利用siRNA方法抑制HCT-8/V細(xì)胞BRCA1表達(dá)，利用MTT方法和CCK-8方法檢測細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)siRNA抑制BRCA1

8、表達(dá)的HCT-8/V細(xì)胞凋亡率的改變，Western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的改變，Rhodamine123檢測細(xì)胞線粒體膜電位的改變。
　　3.通過穩(wěn)定篩選的轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒和BRCA1siRNA質(zhì)粒的HCT-8/V細(xì)胞注射到BABL/c裸鼠建立小鼠移植瘤模型，Western blotting測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白的改變。
　　結(jié)果:
　　1.臨床組織中BRCA1蛋白的表達(dá)敏感患者的陽性率為16.7％(

9、5/30)，而不敏感患者的陽性率為36.7％(11/30)存在明顯差異。
　　2.利用siRNA方法干擾HCT-8/V細(xì)胞BRCA1表達(dá)后，MTT方法檢測顯示，NC siRNA組存活率為89％，BRCA1siRNA組存活率為71％，與NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA質(zhì)粒細(xì)胞存活率明顯的下降(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK-8方法檢測顯示，NC siRNA組存活率為92％，BRCA1siRNA存活率為53％

10、(P＜0.01)。與MTT檢測結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA可以明顯的降低細(xì)胞的存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，
　　流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測結(jié)果顯示，與NC siRNA質(zhì)粒HCT-8/V細(xì)胞凋亡率(0.042±0.007)相比，轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA質(zhì)粒HCT-8/V細(xì)胞凋亡率(0.079±0.09)明顯增加(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　NC siRNA凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)量為(

11、0.63±0.05)，轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA質(zhì)粒組凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)量為(0.86±0.09)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　NC siRNA凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP表達(dá)量為(0.71±0.10)，轉(zhuǎn)染BRCA1siRNA質(zhì)粒組凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP表達(dá)量為(0.92±0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　與NC siRNA質(zhì)粒相(0.91±0.04)比較，轉(zhuǎn)染BRCA1

12、siRNA質(zhì)?？梢悦黠@的降低線粒體膜電位(0.58±0.15)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。
　　3.抑制耐藥細(xì)胞HCT-8/V中BRCA1表達(dá)可以明顯的降低小鼠移植瘤模型腫瘤的生長速度，BRCA1siRNA組小鼠腫瘤重量(0.213±0.022g)，NC siRNA組小鼠(0.522±0.043g)(P＜0.05)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　小鼠移植瘤模型腫瘤組織中，與對(duì)照組Bcl-2表達(dá)水平(0.76±0.09)相比較，

13、BRCA1siRNA組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平出現(xiàn)降低(0.35±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Bax表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯的改變，對(duì)照組Bax表達(dá)水平為0.89±0.11，BRCA1siRNA組Bax表達(dá)水平為0.91±0.09，但是兩種的比率明顯降低，對(duì)照組Bcl-2/Bax為2.54，BRCA1siRNA組為1.20(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　抑制耐藥細(xì)胞HCT-8/V中BRCA1表達(dá)可抑制腫瘤

14、生長，誘導(dǎo)腫瘤凋亡。體內(nèi)抑制BRCA1的表達(dá)能有效抑制裸鼠移植瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第三部分 BRCA1參與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的探討
　　方法:
　　1.Western blotting檢測HCT-8細(xì)胞和HCT-8/V細(xì)胞中P-gp蛋白的表達(dá)，以及利用BRCA1siRNA抑制BRCA1后P-gp蛋白的表達(dá)。
　　2.Western blotting檢測抑制BRCA1基因小鼠移植瘤模型P-gp表達(dá)水平。

15、
　　3流式細(xì)胞術(shù)檢測Rhodamine123熒光強(qiáng)度
　　采用流式細(xì)胞儀，利用Rhodamine123檢測細(xì)胞內(nèi)蓄積情況。Rhodamine123在P-gp的功能檢測中有重要的價(jià)值，可以利用細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123的蓄積情況間接反映P-gp的功能。
　　結(jié)果:
　　1.HCT-8/V細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平(0.89±0.07)較HCT-8細(xì)胞蛋白表達(dá)水平(0.35±0.04)明顯的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

16、(P＜0.01)。HCT-8/V BRCA1siRNA組P-gp蛋白表達(dá)量為(0.41±0.05)，與HCT-8/V細(xì)胞中P-gp表達(dá)水平(0.89±0.07)相比，抑制BRCA1表達(dá)可以明顯的降低P-gp蛋白的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.轉(zhuǎn)染對(duì)照組腫瘤組織P-gp的表達(dá)水平為(1.35+0.23)，轉(zhuǎn)染BRCA1質(zhì)粒組腫瘤組織P-gp的表達(dá)水平(0.78+0.19)，轉(zhuǎn)染BRCA1質(zhì)?？梢悦黠@降低腫瘤

17、組織P-gp的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.抑制BRCA1基因?qū)hodamine123細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響
　　HCT-8組熒光強(qiáng)度為(44.12±3.25)×104，HCT-8/V組熒光強(qiáng)度為(5.23±0.25)×104,HCT-8/VNC siRNA組為(5.78±0.34)×104,HCT-8/V BRCA1siRNA組為(38.68±4.75)×104，結(jié)果顯示HCT-8組和HCT-8/V比

18、較，，HCT-8/V組中Rhodamine123的強(qiáng)度減少，P＜0.01，說明細(xì)胞耐藥和細(xì)胞外排能力增加，和P-gp表達(dá)增加有關(guān)。HCT-8/V BRCA1siRNA組和HCT-8/V NC siRNA組比較，熒光強(qiáng)度增加(P＜0.01)，說明抑制BRCA1可以明顯的增加細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123的強(qiáng)度，提示P-gp功能的減弱，說明BRCA1使P-gp表達(dá)增加，排出Rhodamine123能力增加
　　結(jié)論:
　　P-g