熱CO-,2-氣腹對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的： 結(jié)腸癌腹膜轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的常見(jiàn)因素，嚴(yán)重影響患者的生存。長(zhǎng)期以來(lái)腹膜種植轉(zhuǎn)移一直缺乏令人滿意的處理方法，全身化療雖傳統(tǒng)使用但不能改善患者生存，腹腔熱灌注化療雖可顯著改善患者生存，但術(shù)后并發(fā)癥及死亡率過(guò)高，應(yīng)用范圍有限。 本研究探討一種處理腹膜轉(zhuǎn)移的新方法-熱CO2氣腹(HT-CO2)。該方法通過(guò)加熱腹腔鏡手術(shù)中應(yīng)用的CO2氣腹至熱療作用溫度，形成熱CO2氣腹(42-44℃)，在術(shù)中及術(shù)后注入腹

2、腔，對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移灶以及術(shù)中脫落腫瘤細(xì)胞組織進(jìn)行殺傷，以期起到治療和預(yù)防腹膜轉(zhuǎn)移的作用。本研究首先通過(guò)建立體外熱CO2氣腹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞接憻酑O2氣腹(42-44℃)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷、增殖抑制作用及其作用機(jī)制，進(jìn)而在明確熱CO2氣腹體外作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立體內(nèi)熱CO2氣腹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在?dòng)物體內(nèi)探討熱CO2氣腹的體內(nèi)作用安全性，最終從體外研究及初步的體內(nèi)研究探討了其作為一種新的腹膜轉(zhuǎn)移的治療方法的可能性。 材料與方法： 首先建立

3、體外熱CO2氣腹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，熱CO2氣腹(42℃、43℃或44℃，3小時(shí))作用七株人結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480，LoVo，SW1116，HCT116，Caco-2，HT-29，COLO205)，WST-8法及光鏡觀察檢測(cè)細(xì)胞殺傷和細(xì)胞增殖抑制作用。進(jìn)而通過(guò)熱CO2氣腹對(duì)COLO205細(xì)胞的作用系統(tǒng)深入地探討不同作用溫度和作用時(shí)間(42-44℃，2-4小時(shí))的熱CO2氣腹的殺傷、增殖抑作用，并明確其作用機(jī)制。WST-8法檢測(cè)不同作用溫度和作用時(shí)

4、間熱CO2氣腹對(duì)COLO205的殺傷、增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察(Hoechst33342/PI熒光顯微鏡及透射電鏡)明確細(xì)胞死亡機(jī)制；Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，Rhodamine123流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位改變，熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因等進(jìn)一步明確細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熱CO2氣腹作用后細(xì)胞周期改變，明確細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞增殖抑制的可能機(jī)制。溫度探頭及pH計(jì)檢測(cè)熱CO2氣腹作用后細(xì)胞外

5、環(huán)境溫度和pH改變，HEPES(羥乙基哌嗪乙磺酸)細(xì)胞外酸化抑制試驗(yàn)明確熱CO2氣腹的作用因素。在體外研究基礎(chǔ)上，建立大鼠熱CO2氣腹體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察大鼠熱CO2氣腹處理對(duì)心肺功能、體核溫度的影響及腹膜損傷程度(熱CO2氣腹處理后6、24和96小時(shí)腹膜光鏡和掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察以及處理后2周腹腔粘連評(píng)估)，初步明確熱CO2氣腹在體內(nèi)的作用安全性。 結(jié)果： 熱CO2氣腹對(duì)七株結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷和增殖抑制作用不一。對(duì)于COLO

6、205細(xì)胞，42℃熱CO2氣腹作用3小時(shí)即有顯著的細(xì)胞殺傷和細(xì)胞增殖抑制作用(P＜0.01)，HCT116細(xì)胞則需要43℃作用3小時(shí)(P=0.01)，而SW480、Caco-2和HT-29則需要44℃作用3小時(shí)，LoVo和SW1116細(xì)胞則即使44℃的熱CO2氣腹作用3小時(shí)也無(wú)顯著殺傷和細(xì)胞增殖抑制作用?；贑OLO205細(xì)胞的進(jìn)一步研究顯示熱CO2氣腹在42℃作用3h時(shí)即有顯著的殺傷作用(42℃作用3h，P=0.031；42℃作用3h

7、以上，P＜0.01)，44℃作用4小時(shí)后細(xì)胞存活率降低至49.5±5.5％。Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)及形態(tài)學(xué)(透射電鏡及Hochest33342/PI染色熒光顯微鏡)分析表明細(xì)胞凋亡是熱CO2氣腹作用后細(xì)胞死亡的主要方式。熱CO2氣腹誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性，凋亡比例隨作用溫度和時(shí)間的增加而不斷增加，44℃作用4小時(shí)后12小時(shí)的凋亡檢測(cè)表明凋亡率達(dá)52.63±4.62％(P＜0.001)。熱CO2氣腹誘導(dǎo)凋亡在不同作用溫度和時(shí)

8、間時(shí)細(xì)胞凋亡速度不一，高溫度長(zhǎng)時(shí)間熱CO2氣腹作用能更快地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)在高溫度更長(zhǎng)時(shí)間作用時(shí)，早期凋亡比例下降而中晚期凋亡和壞死比例增加。形態(tài)學(xué)觀察(透射電鏡及Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡)顯示典型的細(xì)胞凋亡改變。對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的進(jìn)一步研究(線粒體膜電位檢測(cè)及WesternBlot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)等)顯示Bax相關(guān)的線粒體途徑在熱CO2氣腹誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著重要作用。流式細(xì)胞術(shù)(Rhodamine-123染色)

9、線粒體膜電位檢測(cè)顯示熱CO2氣腹處理后線粒體膜電位顯著耗散。Westernblot分析表明熱CO2氣腹處理后細(xì)胞色素C自線粒體釋放入胞漿，caspase9被激活，并繼而激活下游caspase3，對(duì)線粒體途徑相關(guān)的上游蛋白Bcl-2家族蛋白和p53蛋白分析顯示Bax蛋白表達(dá)增加，而B(niǎo)ak，Bcl-2，Bcl-xL，和p53則未見(jiàn)表達(dá)改變。受體途徑的相關(guān)蛋白caspase8未見(jiàn)激活。熒光定量PCR對(duì)Bax基因表達(dá)的分析顯示Bax基因表達(dá)并未

10、增加。熱CO2氣腹處理后細(xì)胞外環(huán)境的檢測(cè)表明熱CO2氣腹作用后約30min細(xì)胞外環(huán)境溫度上升至與熱CO2氣腹相同的溫度，細(xì)胞外pH值在10min內(nèi)從7.4降低至6.7，HEPES抑制細(xì)胞外酸化可顯著抑制細(xì)胞殺傷。對(duì)熱CO2氣腹作用后細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析顯示熱CO2氣腹處理后G0/G1期細(xì)胞比率明顯增加，而S期和G2/M期細(xì)胞比率減少，48小時(shí)阻滯作用最為顯著，至72小時(shí)細(xì)胞阻滯開(kāi)始緩解?；诖笫蟮捏w內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示熱CO2氣腹對(duì)大鼠心

11、肺功能的影響與常規(guī)CO2氣腹相比無(wú)顯著差異，熱CO2氣腹作用后體核溫度顯著增高，與作用溫度和作用時(shí)間呈劑量依賴關(guān)系，增高幅度從最低的1.2±0.3℃(43℃作用2小時(shí))到最高的1.7±0.3℃(44℃作用4小時(shí))不等。腹膜形態(tài)學(xué)觀察(光鏡及掃描電鏡)顯示熱CO2氣腹作用后腹膜形態(tài)顯著改變。作用后6小時(shí)可見(jiàn)腹膜表面的系膜細(xì)胞顯著改變(細(xì)胞表面微絨毛數(shù)量減少、塌陷、縮短、消失，細(xì)胞間隙增寬，系膜細(xì)胞脫落，基底膜暴露等)。隨著作用溫度及時(shí)間的

12、增加損傷嚴(yán)重性增加，在高溫度長(zhǎng)時(shí)間作用后系膜細(xì)胞脫落面積在50％以上。作用后24小時(shí)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞粘附浸潤(rùn)腹膜表面，熱CO2氣腹作用后96小時(shí)，在低溫度短時(shí)間的熱CO2氣腹作用組，全部或絕大多數(shù)的腹膜都恢復(fù)正常，但是在高溫度長(zhǎng)時(shí)間熱CO2氣腹作用組(44℃作用3、4小時(shí))，由于損傷較重，細(xì)胞脫落面積大，96小時(shí)后仍有相當(dāng)?shù)膮^(qū)域不能恢復(fù)，腹膜僅為增厚的結(jié)締組織。2周后腹腔粘連評(píng)估顯示熱CO2氣腹作用后增加腹腔粘連(43℃作用2小時(shí)和44℃作

13、用4小時(shí)各有一例粘連)。 結(jié)論： 一定劑量水平的熱CO2氣腹對(duì)多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞株有殺傷作用和細(xì)胞增殖抑制作用，但是不同結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)于熱CO2氣腹的敏感性不一，某些細(xì)胞株對(duì)熱CO2氣腹敏感，而有些細(xì)胞株則相對(duì)耐受?；诮Y(jié)腸癌細(xì)胞株COLO205細(xì)胞的研究提示熱CO2氣腹殺傷作用與熱CO2氣腹的熱作用及降低細(xì)胞外pH酸化細(xì)胞外環(huán)境有關(guān)，熱CO2氣腹誘導(dǎo)Bax相關(guān)的線粒體機(jī)制的細(xì)胞凋亡是其殺傷作用的主要細(xì)胞分子作用機(jī)制。熱CO