PAC-1聯(lián)合MCP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國(guó)，近幾年結(jié)腸癌成為發(fā)病率上升最快的癌癥之一。盡管近年來(lái)結(jié)腸癌的治療水平有了很大的提高，但是其五年生存率仍徘徊在30-66％之間，沒(méi)有明顯提高。化療是結(jié)腸癌治療的一個(gè)重要步驟，但化療耐藥及其毒副作用卻限制了其療效的進(jìn)一步提高。原因之一是這些藥物的作用靶點(diǎn)都是位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游或中游，凋亡級(jí)聯(lián)系統(tǒng)下游的執(zhí)行蛋白仍有可能受其他信號(hào)通路的影響而抵抗細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。因此尋求一種能特異性誘

2、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且毒副作用小的靶向藥物已成為研究熱點(diǎn)。
　　 分子靶向治療就是針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵大分子，包括參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和其他生物學(xué)途徑的重要靶點(diǎn)，通過(guò)特異性阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，來(lái)控制其基因表達(dá)和改變生物學(xué)行為，或是通過(guò)阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。相對(duì)于手術(shù)、放療、化療三大傳統(tǒng)治療手段，分子靶向治療具有較好的分子選擇性，能高效并選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，減少

3、對(duì)正常組織的損傷。
　　 半胱天冬酶原活化復(fù)合物-1（procaspase-activating compound-1，PAC-1）是美國(guó)伊利諾伊大學(xué)P.J.Hergenrother教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組通過(guò)篩選25000多種物質(zhì)后發(fā)現(xiàn)的一種小分子復(fù)合物，它能高效活化半胱天冬酶原-3（procaspase-3）轉(zhuǎn)化為半胱天冬酶（caspase-3），而后者是細(xì)胞凋亡通路下游的凋亡執(zhí)行關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
　

4、　 低分子柑桔果膠是從天然果膠產(chǎn)物中提取得到的一種以半乳糖為主要成份的多糖，研究發(fā)現(xiàn)低分子柑桔果膠是體內(nèi)半乳糖凝集素-3(Galectin-3)配體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它與Bcl-2有明顯的序列相似性，在羧基端都含有NWGR基序，而該基序是Bcl-2抑制凋亡所必需的。Bcl-2抑制凋亡的癌基因，作用于內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。
　　 雖然既往的研究已經(jīng)證實(shí)PAC-1和低分子柑桔果膠可以通過(guò)作用于不同的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白或關(guān)鍵途徑發(fā)揮

5、抗腫瘤作用，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否能夠具有更強(qiáng)的促進(jìn)凋亡、抗腫瘤作用，它們對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及其機(jī)理如何，目前國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。根據(jù)：caspase-3是凋亡通路下游的執(zhí)行蛋白，Bcl-2通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路上游的Cyt-c的釋放來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡，我們推測(cè)PAC-1聯(lián)合低分子柑桔果膠可以通過(guò)直接活化caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制Bcl-2的活性從而提高內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路活性兩方面來(lái)提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　 實(shí)驗(yàn)

6、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)采用PAC-1和低分子柑桔果膠，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行以下研究：1）PAC-1和低分子柑桔果膠對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，進(jìn)一步從caspase-3、8、9、PARP及bcl-2的表達(dá)和細(xì)胞周期深入探討其抗腫瘤的機(jī)制；2）明確PAC-1聯(lián)合低分子柑桔果膠對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響并探索其內(nèi)在機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW116、HCT116、HT-29、SW620

7、和SW480。
　　 2、MTT比色法評(píng)價(jià)不同濃度PAC-1/低分子柑桔果膠處理上述細(xì)胞72h后對(duì)上述人結(jié)腸癌細(xì)胞的體外增殖抑制作用，并計(jì)算PAC-1/低分子柑桔果膠對(duì)上述人結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50，選出對(duì)PAC-1敏感和不敏感的細(xì)胞各一株。
　　 3、MTT比色法評(píng)價(jià)IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠能否提高對(duì)PAC-1敏感和不敏感的細(xì)胞株的增殖抑制作用。
　　 4、顯

8、微鏡觀察不同濃度PAC-1處理后上述人結(jié)腸癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度PAC-1對(duì)敏感和不敏感的細(xì)胞株處理后凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞周期的變化；IC50劑量的PAC-1對(duì)敏感和不敏感的細(xì)胞株處理不同時(shí)間后凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞周期的變化；IC50劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠對(duì)敏感和不敏感的細(xì)胞株處理后凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞周期的變化。
　　 6、Western bloting檢測(cè)IC5

9、0劑量的PAC-1單用及聯(lián)合5mg/ml劑量的低分子柑橘果膠對(duì)敏感和不敏感的細(xì)胞株處理后，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、8、9、PARP、Rock-1、bcl-2的蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 7、采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較實(shí)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方差；多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析法，如方差齊用LDS法，方差不齊，用Dunnett-t檢驗(yàn)方法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為具有顯著性差異。所有計(jì)量

10、資料以x±s表示。
　　 結(jié)果：
　　 1、PAC-1對(duì)5種人結(jié)腸癌細(xì)胞株在體外均有明顯的增殖抑制作用，且成劑量依賴。各細(xì)胞株對(duì)PAC-1的IC50分別是：SW116：22.75±8.70umol/L、HCT116：2.98±1.08 umol/L、HT-29：11.27±2.24 umol/L、SW620 ：3.65±0.21 umol/L和SW480：4.08±1.12 umol/L，其中以SW116最不敏感，HC

11、T116最敏感。因高濃度的低分子柑橘果膠的無(wú)法溶解，故MTT實(shí)驗(yàn)無(wú)法順利完成。
　　 2、選擇對(duì)PAC-1的細(xì)胞增殖抑制作用不敏感的細(xì)胞SW116和較敏感的細(xì)胞 SW620，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 3、因高濃度的低分子柑橘果膠無(wú)法溶解，因此聯(lián)合作用低分子柑橘果膠選擇細(xì)胞增殖抑制作用約50％、可幾乎完全溶解的濃度5mg/ml；聯(lián)合IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW620細(xì)胞（SW116：

12、IC25≈1/4IC50，IC75≈4 IC50；SW620：IC25≈1/3IC50，IC75≈3 IC50）CI值分別為：IC25的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：1.54638；IC50的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：0.57996；IC75的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果膠：0.80478。低濃度的PAC-1與低分子柑橘果膠聯(lián)合起拮抗作用CI＞1；中、高濃度的PAC-1與低分子柑橘果膠聯(lián)合起協(xié)同作用

13、CI＜1，其中以中濃度的PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用最好。
　　 4、顯微鏡觀察不同濃度PAC-1對(duì)SW116和SW620細(xì)胞處理2h后開始出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，且隨時(shí)間和濃度增加細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡特征越明顯，如染色質(zhì)的凝聚、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞核斷裂以及相關(guān)凋亡小體的出現(xiàn)。此結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
　　 5、采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW62

14、0細(xì)胞4、8、24、48h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)：IC25的PAC-1處理后4h凋亡細(xì)胞比例與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性增加（P＞0.05），當(dāng)濃度增至IC50或IC75時(shí)凋亡細(xì)胞比例較空白對(duì)照組顯著增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 6、采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml的低分子柑橘果膠作用于SW116和SW620細(xì)胞4、8、24、48h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞比例

15、發(fā)現(xiàn)：與PAC-1單藥相比，相同時(shí)間聯(lián)合用藥能顯著增加細(xì)胞凋亡比例，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 7、PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠可誘導(dǎo)G0/G1 期細(xì)胞增加，G2/M期細(xì)胞減少，產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，具有時(shí)間和濃度依賴性。
　　 8、應(yīng)用Western bloting方法檢測(cè)IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1作用于SW116和SW620細(xì)胞4、8、24、48h后，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、

16、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表達(dá)水平的情況，發(fā)現(xiàn)：隨時(shí)間和濃度增加，caspase-3、8、9、PARP的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 9、應(yīng)用Western bloting方法檢測(cè)IC25、IC50、IC75劑量的PAC-1聯(lián)合5mg/ml的低分子柑橘果膠作用于SW116和SW620細(xì)胞4、8、24、48h后凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表達(dá)水平的情況，發(fā)現(xiàn)

17、：與PAC-1單藥相比，聯(lián)合用藥后caspase-3、8、9、PARP上調(diào)、bcl-2下調(diào)的趨勢(shì)更明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、PAC-1對(duì)5種人結(jié)腸癌細(xì)胞均有明顯的誘導(dǎo)凋亡和增殖抑制作用。
　　 2、低濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡有拮抗作用；中、高濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡表現(xiàn)為協(xié)同作用，以中濃度PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠的協(xié)同作用效果最佳。<

18、br>　　 3、PAC-1單用及聯(lián)合低分子柑橘果膠能顯著增加caspase-3的活化和PARP的裂解，對(duì)caspase-8、9的活化作用不明顯，表明PAC-1是直接高效活化細(xì)胞凋亡通路下游的凋亡關(guān)鍵執(zhí)行蛋白caspase-3；聯(lián)合用藥對(duì)caspase-9的活化作用優(yōu)于PAC-1單用，Bax/bcl-2的比值也明顯升高，表明線粒體途徑是PAC-1聯(lián)合低分子柑橘果膠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 4、PAC-1單用及聯(lián)合低分