癌胚抗原對結(jié)腸癌進展作用機制的初步研究.pdf

1、第一部分:癌胚抗原受體在消化系統(tǒng)各器官的表達及意義
　　目的:研究癌胚抗原受體(CEAR)在消化器官主要組織細胞中的表達并探討其腫瘤學意義。
　　方法:以健康雄性BALB/c小鼠20只為研究對象，以免疫組織化學的方法檢測食管、胃、小腸、結(jié)腸、胰、肝等器官組織中的CEAR表達情況，并以酶消化和密度梯度離心的方法提取分離肝臟Kupffer細胞，采用細胞免疫化學方法檢測CEAR表達情況。
　　結(jié)果:(1) CEAR在消化管黏

2、膜上皮的胞質(zhì)和胞核均有表達，表達強度在食管黏膜上皮為弱陽性，在胃、小腸黏膜上皮為中等程度陽性，在結(jié)腸黏膜上皮為強陽性，以結(jié)腸絨毛上皮及腺體開口處黏膜上皮為最強;在食管、胃、小腸、結(jié)腸平滑肌中為中等稍弱強度的陽性表達，位置主要在胞質(zhì);而黏膜下層纖維組織及外膜未見明顯表達。與臨床上消化管腫瘤CEA陽性率:結(jié)腸癌＞胃癌＞食管癌的規(guī)律一致。(2) CEAR在胰腺胰島中幾乎所有細胞呈中等強度陽性表達，位置在胞核和胞質(zhì);而在胰腺外分泌部的腺泡、閏管

3、、外膜均未見明顯表達。與臨床上胰腺內(nèi)分泌細胞瘤CEA陽性率遠高于胰腺癌的臨床現(xiàn)象一致。(3) CEAR在肝臟中主要在肝細胞和Kupffer細胞的胞質(zhì)呈中等強度的陽性表達，而血竇內(nèi)皮及肝臟外膜未見明顯表達。與原發(fā)性肝癌CEA陽性率較結(jié)腸癌低、結(jié)腸癌癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的臨床現(xiàn)象一致。(4) CEAR在全部陽性細胞中表達位置（P＜0.01）和表達強度（P＜0.01）均存在顯著差異。這種廣泛而差異化的表達為CEA/CEAR途徑對不同細胞進行普遍的差

4、異化功能調(diào)控提供了條件。
　　結(jié)論:CEAR在消化器官主要組織細胞的表達具有廣泛而差異化的特點，與消化器官CEA陽性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，尤其對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移可能有重要作用，內(nèi)在機制有待研究。
　　第二部分:癌胚抗原陽性結(jié)腸癌CT26細胞株的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)的小鼠結(jié)腸癌CT26細胞株。
　　方法:以重組CEACAM5-eGFP-cDNA慢

5、病毒和重組eGFPcDNA慢病毒分別轉(zhuǎn)染鼠結(jié)腸癌CT26細胞，抗生素篩選2w，以有限稀釋法獲得CEA陽性細胞單克隆，體外培養(yǎng)至第7代和第14代進行鑒定。以野生型CT26細胞為對照，用熒光顯微鏡和免疫細胞化學法觀察CEACAM5表達位置，用RT-PCR法對CEACAM5 mRNA表達進行鑒定，用western blot法對CEACAM5蛋白表達進行鑒定，用ELISA法檢測CEACAM5蛋白產(chǎn)量。以第14代CT26CEA細胞及第12代CT2

6、6細胞分別建立BALB/c鼠皮下種植瘤模型，體內(nèi)傳代至第5代，用活體熒光成像法和免疫組織化學法對瘤體CEACAM5表達進行鑒定，用ELISA法檢測小鼠血漿CEACAM5蛋白濃度。
　　結(jié)果:(1)獲得有明亮綠色熒光的單克隆CT26CEA細胞株及熒光對照CT26GFP細胞株。(2)第7代、第14代CT26CEA細胞可在熒光顯微鏡下觀察到細胞質(zhì)內(nèi)融合蛋白發(fā)出的明亮綠色熒光，而CT26細胞未見熒光。(3)第7代、第14代CT26CEA細

7、胞免疫化學檢測呈陽性，位置在細胞質(zhì)，呈黃色或淺棕色，而CT26細胞免疫化學檢測呈陰性。(4)第7代、第14代CT26CEA細胞總RNA中均檢測到CEACAM5 mRNA表達，而CT26細胞則未檢測到CEACAM5mRNA表達。(5)在第7代、第14代CT26CEA細胞裂解液中可檢測到CEACAM5蛋白表達，而CT26細胞則未檢測到CEACAM5蛋白表達。(6)第7代、第14代CT26CEA細胞體外培養(yǎng)24h CEA產(chǎn)量分為265±71n

8、g/106cell和，213±66ng/106cell，差異無統(tǒng)計學意義。(7)兩株細胞皮下注射法均可使小鼠致瘤，14d成瘤率為100％(n=8)。經(jīng)體內(nèi)傳代至第5代，致瘤率均為100％(n=8)。所有CEACT26皮下瘤可在藍色光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，免疫組化檢測CEA均呈陽性，表達位置主要在細胞質(zhì)，而CT26皮下瘤未見無熒光，免疫組化染色呈陰性。CEACT26細胞株建立的第1代荷瘤小鼠14d血清CEA濃度與第5代荷瘤小鼠相比無統(tǒng)計學意

9、義，但均顯著高于CT26細胞株荷瘤小鼠(P＜0.01)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌CT26CEA細胞株，能夠在體外培養(yǎng)及小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達CEA，為研究CEA對結(jié)腸癌細胞生物學特性的影響及對小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌進展的影響提供了便利研究工具。
　　第三部分:內(nèi)生性癌胚抗原對結(jié)腸癌生長及轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:研究內(nèi)生性癌胚抗原對體外培養(yǎng)環(huán)境下結(jié)腸癌細胞粘附、遷移、侵襲、增殖、凋亡等生物學特性的影響及對小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移的

10、影響。
　　方法:以野生型CT26細胞株、前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達CEA的CT26CEA細胞株和僅表達熒光蛋白的CT26GFP細胞株為研究對象，用MTT法檢測細胞粘附能力，用transwell法檢測細胞遷移能力及侵襲能力，用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布、計算增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)，用MTT法繪制細胞生長曲線、計算細胞群體倍增時間。進一步建立BALB/c小鼠皮下種植瘤模型，比較14d致瘤率和瘤體質(zhì)量，以末端標記法(Tunel法)檢測皮下種植瘤細

11、胞凋亡情況，并用脾臟注射法建立BALB/c小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，比較肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率及轉(zhuǎn)移灶個數(shù)。
　　結(jié)果:(1)CT26CEA細胞株與CT26GFP細胞株相比，黏附能力提高14.7％（P＜0.01），遷移能力提高21.8％（P＜0.01），侵襲能力提高39.5％(P＜0.01)，而CT26GPF細胞株與CT26細胞株相比，粘附、遷移及侵襲能力差異無統(tǒng)計學意義。(2)三株細胞周期分布、增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。(3)三株細

12、胞體外生長曲線及細胞群體倍增時間差異無統(tǒng)計學意義。(4)三株細胞皮下種植瘤14d成瘤率均為100％，但CT26CEA細胞株與CT26GPF細胞株相比，成瘤更早(P＜0.05)，瘤體質(zhì)量更大(P＜0.01);三株癌細胞瘤體內(nèi)凋亡指數(shù)均小于4％，差異無統(tǒng)計學意義。(5)三株細胞脾臟種植瘤模型肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率無顯著差異，但CT26CEA細胞株與CT26GPF細胞株相比，肝轉(zhuǎn)移灶個數(shù)顯著增多（P＜0.01）。
　　結(jié)論:內(nèi)生性癌胚抗原可以促進