黃連堿的結(jié)腸癌預(yù)防作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：黃連堿是傳統(tǒng)中藥黃連的特征性成分之一，研究表明，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)活性，但其抗腫瘤方面的作用尚不清楚。本論文旨在探討黃連堿對(duì) HCT-116型結(jié)腸癌的預(yù)防作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)闡述，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：⑴建立了結(jié)腸癌的體內(nèi)預(yù)防模型，通過(guò)對(duì)黃連堿預(yù)保護(hù)處理的裸鼠進(jìn)行皮下接種結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116，誘導(dǎo)移植瘤的發(fā)生，考察黃連堿的預(yù)防效果。實(shí)驗(yàn)將裸鼠隨機(jī)分為5組：正常

2、對(duì)照組、腫瘤對(duì)照組、50 mg/k g黃連堿組、100 mg/k g黃連堿組和150 mg/k g黃連堿組。藥物組均在接種前給予灌胃黃連堿處理2天，皮下接種后，每組繼續(xù)灌胃給藥相應(yīng)劑量黃連堿25天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與腫瘤對(duì)照組相比，藥物組平均離體瘤重減少，平均荷瘤體積也明顯減小。其中，高劑量黃連堿組（150 mg/k g）的平均離體瘤重和平均瘤體積與腫瘤對(duì)照組相比差異顯著，并且延長(zhǎng)了腫瘤發(fā)生的潛伏期。此外，采用多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)檢

3、測(cè)裸鼠荷瘤25天后的血清腫瘤標(biāo)志物水平，結(jié)果表明，給藥后，CEA、CA19-9和CYFRA21-1水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，黃連堿給藥組裸鼠的體重雖均比正常對(duì)照組低，但重要臟器指數(shù)（心、肝、脾、肺、腎）并未受到影響，表明黃連堿長(zhǎng)期給藥對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)狀況無(wú)不良影響。以上結(jié)果表明，黃連堿可以有效的抑制結(jié)腸癌的形成。⑵基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原理，依據(jù)反向藥效團(tuán)匹配方法預(yù)測(cè)了黃連堿的藥理作用靶點(diǎn)。借助 KEGG等生物分子功能軟件靶點(diǎn)信息的注釋，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)

4、可視化軟件，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，黃連堿藥理作用集中于代謝性疾病、癌癥、免疫疾病和心血管疾病等。信號(hào)通路富集結(jié)果表明，黃連堿主要靶點(diǎn)蛋白與 PI3K-Akt信號(hào)通路和癌癥途徑等信號(hào)通路相關(guān)。其中，AKR1C3、CCNA2、ESR1和 IL2可能是黃連堿防治癌癥的重要作用靶點(diǎn)。⑶利用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)分析了黃連堿對(duì)于HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用。采用Hoec hs t染色及熒光顯微鏡觀察，黃連堿作用后，人結(jié)腸癌細(xì)胞

5、HCT-116的形態(tài)學(xué)變化，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了HCT-116細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的分布。進(jìn)一步采用Western blot和qRT-PCR分析了黃連堿對(duì)凋亡、周期和生存信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，黃連堿可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)，高劑量黃連堿還能夠造成 G0/G1期細(xì)胞周期阻滯。同時(shí)，黃連堿通過(guò)抑制 PI3K-AKT、MEK-ERK通路，遏制細(xì)胞生長(zhǎng)；還誘發(fā) Caspase8-Caspase3

6、級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起外源性細(xì)胞凋亡；并且，對(duì) Cyclin E-CDK2和 Cyclin D-CDK4復(fù)合物也有一定抑制效果。⑷采用qRT-PCR法對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤組織和肺臟組織中癌癥相關(guān)基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黃連堿能夠抑制腫瘤組織中原癌基因 TN F-β和 K RAS的表達(dá)，激活抑癌基因 p53，同時(shí)下調(diào) MAPK通路相關(guān)基因 mRNA的表達(dá)。在肺臟組織中，黃連堿同樣可以抑制 KRAS、BRAF的表達(dá)，下調(diào) MEK-ERK通路的 Mrna水