自噬性死亡在結(jié)腸癌化療中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。我國(guó)東南沿海地區(qū)發(fā)病率相對(duì)較高，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，主要與環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)。 程序性細(xì)胞死亡(PCD)對(duì)于癌細(xì)胞的惡性增值至關(guān)重要。因此，了解程序性死亡的機(jī)制以及設(shè)計(jì)特定的誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的治療方案對(duì)疾病的治療具有重要意義。程序性細(xì)胞死亡有兩種，包括凋亡和自噬性死亡，二者具有不同的形態(tài)學(xué)特征. 凋亡(Ⅰ型PCD)是一種細(xì)胞自發(fā)的死亡機(jī)制，受多種細(xì)胞信號(hào)

2、通路的調(diào)控。凋亡具有依賴caspase參與，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝集，DNA降解和形成凋亡小體等特征。缺少凋亡性細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生，而過(guò)度的凋亡常常又與神經(jīng)退行性疾病相聯(lián)系。 自噬性細(xì)胞死亡(Ⅱ型PCD)是另一種重要的生物學(xué)細(xì)胞死亡方式，這種細(xì)胞死亡的主要特征是大量的細(xì)胞內(nèi)含物降解，包括重要的細(xì)胞器如線粒體，被包裹進(jìn)膜狀的自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體并進(jìn)行降解。自噬在腫瘤的發(fā)展中具有重要的作用，癌細(xì)胞

3、的自噬水平低于相對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞。 很多研究表明自噬與凋亡在一些情況下相互影響，甚至在有些情況下，二者受控于同一刺激物并產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)。二者的相互作用取決于細(xì)胞環(huán)境和所受的刺激物，凋亡的發(fā)生有可能依賴于自噬的存在；其它一些情況下，自噬可能阻止凋亡的發(fā)生，抑制自噬可以提高細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性；也有一些情況下二者同時(shí)存在，但是相互獨(dú)立的，抑制自噬活動(dòng)可使細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)從Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡轉(zhuǎn)向Ⅰ型。 Bax和PUM

4、A是關(guān)鍵的凋亡調(diào)控因子，缺失Bax和PUMA或者表達(dá)Bcl-2會(huì)抑制凋亡的發(fā)生，而這種凋亡性死亡的缺失會(huì)影響發(fā)育和促進(jìn)腫瘤發(fā)生。因此在凋亡性死亡缺失的情況下，研究其它死亡方式的發(fā)生及其機(jī)制對(duì)癌癥的治療具有重要意義。 近年來(lái)，隨著對(duì)自噬多種功能研究的不斷深入，自噬在人類疾病中的作用，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、免疫和防御也逐步得到認(rèn)同。在對(duì)自噬眾多功能的研究中，其在細(xì)胞死亡和細(xì)胞生存中的作用是尤為重要和倍受爭(zhēng)議的一個(gè)方面。

5、傳統(tǒng)的腫瘤治療方案主要以凋亡為靶標(biāo)，但是腫瘤發(fā)生過(guò)程中凋亡受抑已經(jīng)是被廣泛認(rèn)知的重要事件。清除癌細(xì)胞不能僅僅通過(guò)凋亡性死亡，還可以通過(guò)其它死亡方式比如自噬性死亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)?shù)蛲鍪芤謺r(shí)，如果我們能夠激發(fā)自噬性死亡，這可能成為一種腫瘤治療的新方案。本課題就此展開(kāi)研究： 第一部分，凋亡途徑缺失對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性的影響 本部分實(shí)驗(yàn)使用5-FU(0，10，20，40μg/ml)處理結(jié)腸癌HCT116，HCT116 Bax-/-和

6、HCT116 PUMA-/-細(xì)胞24小時(shí)，WST-8法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)5-FU可以明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，呈現(xiàn)劑量依賴性，且野生型細(xì)胞和凋亡缺失細(xì)胞在各劑量點(diǎn)具有相近的死亡率。收集處理細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)野生型HCT116細(xì)胞的凋亡率顯著高于缺失細(xì)胞，但凋亡缺失細(xì)胞具有相對(duì)較高的PI攝入，綜合以上結(jié)果提示我們?cè)谌笔Ъ?xì)胞中可能存在其它的死亡方式，比如自噬性死亡。 第二部分，自噬性死亡在化療藥物處理凋亡缺失結(jié)腸癌細(xì)胞中的

7、作用 (一)5-FU處理凋亡缺失結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生 進(jìn)而，我們對(duì)5-FU處理后的細(xì)胞進(jìn)行自噬的相關(guān)檢測(cè)，電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，在缺失細(xì)胞中可見(jiàn)多個(gè)膜狀囊泡包裹細(xì)胞內(nèi)含物，說(shuō)明存在自噬的發(fā)生，而在野生型細(xì)胞中無(wú)明顯自噬泡出現(xiàn)，但有凋亡樣細(xì)胞形態(tài)。為了進(jìn)一步證實(shí)自噬的發(fā)生，我們采用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116，HCT116 Bax-/-和HCT116 PUMA-/-細(xì)胞，5-FU處理后進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)，在缺失細(xì)胞

8、處理組中發(fā)現(xiàn)明顯的散點(diǎn)狀熒光分布，而野生型對(duì)應(yīng)組為彌散樣熒光分布。PI3K-Akt-mTOR是自噬發(fā)生的負(fù)調(diào)控機(jī)制，在癌細(xì)胞中，mTOR的抑制已被認(rèn)為與自噬的發(fā)生緊密相連，它的關(guān)鍵下游底物是p70s6k。因此我們利用Western blot檢測(cè)和比較野生型和凋亡缺失細(xì)胞中p70s6k的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡缺失細(xì)胞中p70s6k的表達(dá)水平明顯低于野生型細(xì)胞，表明凋亡缺失細(xì)胞中自噬性信號(hào)通路被激活。這些結(jié)果證實(shí)在5-FU處理的凋亡缺失細(xì)胞

9、中存在自噬的發(fā)生。 (二)抑制自噬降低凋亡缺失細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性 自噬是一個(gè)高度保守的過(guò)程，而在一些特定的情況下，它也可以作為一種細(xì)胞死亡方式。在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們使用3-MA(3-甲基腺嘌呤)作為自噬的抑制劑，電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)5-FU聯(lián)合3-MA處理的細(xì)胞中只有很少或幾乎沒(méi)有自噬泡的出現(xiàn)；5-FU單獨(dú)處理誘導(dǎo)的點(diǎn)狀熒光分布在聯(lián)合3-MA處理后也變?yōu)閺浬訜晒夥植?。在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢