結(jié)腸癌細(xì)胞獲得性5-氟脲嘧啶耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、本研究將采用高濃度的5-FU來(lái)處理人結(jié)腸癌DLDl和DLD1-TRAIL/R細(xì)胞，以建立獲得性5-FU耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞，并通過(guò)分析耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性，以探討獲得性5-FU耐藥的可能機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法：在臺(tái)盼藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)存活細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定；通過(guò)Western免疫印跡檢測(cè)各種蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的測(cè)定；在得到細(xì)胞存活率后用CurveExpert軟件計(jì)算各種化療藥物的IC50；各處理

2、組間的差異采用配對(duì)的t檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估。 研究結(jié)果與討論：1)、5-FU耐藥細(xì)胞株的建立及細(xì)胞活力測(cè)定：用濃度逐漸增高(10μM-400μM)的5-FU反復(fù)處理DLD1和DLD1-TRAIL/R細(xì)胞后，最終得到了5-FU耐藥的細(xì)胞，細(xì)胞再經(jīng)不同濃度的5-FU處理4天后，DLD-1細(xì)胞的IC50為2.5μM，而DLD1-5-FU/R的則高達(dá)210.6μM(后者為前者的84倍)；與此同時(shí)DLD1-TRAIL/R的IC50僅為4.4μM，而

3、DLD1-TF/R的卻高達(dá)105.7μM(后者為前者的24倍)，(P＜0.01)。另外耐藥細(xì)胞經(jīng)紫杉醇、順鉑、絲裂霉素以及TRAIL蛋白處理后其IC50與親代細(xì)胞無(wú)明顯差異(P＞0.05)，說(shuō)明這些耐藥細(xì)胞是對(duì)5-FU特異性耐藥。2)、各種蛋白及Bcl-2家族在5-FU耐受細(xì)胞株中的過(guò)表達(dá)及S期停滯在5-FU耐受細(xì)胞的改變：Western免疫印跡結(jié)果顯示胸苷酸合成酶、Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-w、XIAP、survivin和I

4、LP-2等蛋白在四個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)無(wú)明顯差別。Mdr蛋白在DLD1-TF/R中的表達(dá)比其他細(xì)胞略高；而B(niǎo)ik、Bcl-Xs以及Bcl-XL蛋白在耐藥細(xì)胞DLD1-5-FU/R和DLD1-TF/R中的表達(dá)均比各自的親代細(xì)胞明顯增高，其中Bcl-XL是唯一抗凋亡的保護(hù)性蛋白，這說(shuō)明Bcl-XL蛋白可能是在5-FU耐藥中起了重要的作用。用不同濃度的5-FU處理細(xì)胞3天后分析其細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)5-FU可以誘導(dǎo)敏感細(xì)胞停滯于S期，而對(duì)耐藥細(xì)胞

5、的細(xì)胞周期幾乎沒(méi)有影響。接著用200μM濃度的5-FU處理5-FU敏感細(xì)胞24小時(shí)，磷酸化H2A.X的表達(dá)明顯增高，而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)就越高；然而用相同濃度的5-FU處理5-FU耐藥的細(xì)胞，未見(jiàn)相同的現(xiàn)象，這說(shuō)明5-FU的耐藥與DNA的損傷相關(guān)。3)、過(guò)表達(dá)的Bcl-XL蛋白在5-FU耐藥中的作用：我們通過(guò)將pGT60-hBcl-XL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至DLD1親代細(xì)胞得到穩(wěn)定高表達(dá)Bcl-XL的細(xì)胞克隆(DLD-1/Bcl-XL)。接

6、著數(shù)據(jù)顯示5-FU在DLD1/Bcl-XL細(xì)胞中的IG50為4.5μM，是親代DLD1細(xì)胞的1.8倍。同樣，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果以及Western免疫印跡法對(duì)caspase-3的檢測(cè)結(jié)果均提示高表達(dá)Bcl-XL對(duì)5-FU誘導(dǎo)的凋亡具有一定的保護(hù)作用，但是結(jié)果同時(shí)也顯示DLD1/Bcl-XL細(xì)胞在5-FU處理后仍然出現(xiàn)S期停滯和磷酸化H2A.X水平的升高。 研究結(jié)論： 1)、獲得性5-FU耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞中存在Bcl-XL的