FAK靶向RNAi對結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶化療增敏作用及機制研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文FAK靶向RNAi對結(jié)腸癌5氟尿嘧啶化療增敏作用及機制研究姓名：陳玉英申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：梁后杰20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文苷酸技術(shù)。多細胞球(multicellularspheroids，MCSs)是很好的能模擬體內(nèi)實體瘤細胞特性的模型，與單層細胞相比，MCSs更接近體內(nèi)腫瘤的情況。因此本課題擬采用三維多細胞球培養(yǎng)模型，通過RNA干擾抑制FAK的表達，先通過體外實驗研究其對多細胞

2、球藥物5FU敏感性的影響，進而通過體內(nèi)實驗研究其對裸鼠移植瘤藥物5FU敏感性的影響，并初步探討分子機制。研究方法1應(yīng)用免疫組化及Westemblotting檢測FAK在四種結(jié)腸癌細胞株中的表達，并檢測結(jié)直腸癌組織標本中FAK、磷酸化FAKpY397、AKT、NF—KB、Caspase一3、Bcl—2等凋亡通路相關(guān)蛋白的表達情況，分析與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，以及與FAK表達的相關(guān)性。2構(gòu)建FAKRNAi載體，對體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HT29細胞進

3、行轉(zhuǎn)染，篩選相應(yīng)穩(wěn)定表達克隆，干擾HT29細胞中FAK表達，并采用免疫組化、RTPCR、Real一timePCR、Westernblotting等方法鑒定FAK的被抑制情況。3將干擾前后的細胞進行三維多細胞球體培養(yǎng)，采用血球記數(shù)法檢測抑制FAK表達對多細胞球的增殖的影響，通過MTT法和CCK一8試劑盒檢測抑制F：AK表達對多細胞球5Fu敏感性的影響，并應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測抑制FAK表達對多細胞球的藥物5一FU誘導(dǎo)凋亡的影響。4采用West

4、emblotting檢測干擾前后多細胞球體中與FAK介導(dǎo)生存信號通路相關(guān)的凋亡蛋白磷酸化FAKpY397、AKT、NFKB、caspase3、Bcl一2等的水平，初步探討抑制FAK表達增加結(jié)腸癌多細胞球?qū)?Fu的敏感性的分子機制。5采用培養(yǎng)細胞皮下接種法建立裸鼠移植瘤模型，觀測FAK干擾對裸鼠移植瘤生長的抑制作用。6應(yīng)用Westemblotting檢測不同組裸鼠移植瘤中FAK、磷酸化FAKpY397、AKT、NFKB、Caspase3、

5、Bcl一2等抗凋亡通路相關(guān)蛋白的表達情況，初步探討抑制FAK表達對裸鼠移植瘤生長抑制的分子機制。結(jié)果1四種結(jié)腸癌細胞株LoVo、HCTll6、HT_29、SW480內(nèi)都能檢測到FAK蛋白，其中HT29細胞中的FAK表達最高。結(jié)腸癌組織標本中FAK、FAKpY397、AKT、NF—KB、Caspase一3、Bcl2的陽性率分別為8243％、4595％、5270％、5946％、4865％、7027％，與正常結(jié)腸壁組織組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(