人穿孔素和精子蛋白17放射誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和疾病的基因治療中常常需要對基因表達(dá)進(jìn)行時(shí)空調(diào)控。早期生長反應(yīng)因子1(early growth response-1，Egr-1)基因啟動子區(qū)含有6個(gè)高度保守的CC(A+T)<,6>GG基序(motif)，可在電離輻射產(chǎn)生的氧自由基刺激下誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控。我們利用Egr-1啟動子的這一特性，分別將人穿孔素全長cDNA和人精子蛋白17 cDNA連接到Egr-1啟動子下游，構(gòu)建成表達(dá)載

2、體，對這2個(gè)基因進(jìn)行了放射誘導(dǎo)表達(dá)研究。 一、穿孔素放射誘導(dǎo)表達(dá)體系的初步研究 穿孔素(perforin，PFN)是CTL和NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要毒性蛋白。PFN在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。PFN是糖基化蛋白，原核表達(dá)的.PFN蛋白未能糖基化修飾可能對其活性有一定影響，我們擬采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PFN蛋白，以期在體外研究PFN蛋白對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 1.穿孔素真核表達(dá)載體的構(gòu)建和在COS7細(xì)胞中

3、的表達(dá)。以帶有人pfn全長cDNA的質(zhì)粒pCR2.1/pill為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PFN第64位密碼子至終止密碼子之間的DNA片段(去掉信號肽序列)。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/pfn，經(jīng)酶切和測序鑒定。DNA序列測定證實(shí)，擴(kuò)增的pfn基因序列與國外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/pfn轉(zhuǎn)入COS7細(xì)胞。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞RNA。結(jié)果僅pcDNA3.1(+)/pfn轉(zhuǎn)染的CO

4、S7細(xì)胞有pfn擴(kuò)增帶，這證明pfn在COS7細(xì)胞中有mRNA水平的表達(dá)，但用免疫細(xì)胞化學(xué)未能檢測到蛋白的表達(dá)。 2.穿孔素放射誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建和在COS7細(xì)胞中的表達(dá)。以質(zhì)粒pGEgr-1p為模板，應(yīng)用Egr-1p上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Egr-1p擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/pfn分別經(jīng)Mlu I、Kpn I雙酶切消化后連接構(gòu)建成pEer-pfn重組質(zhì)粒，即用Egr-1啟動子代替pcDNA3.

5、1(+)質(zhì)粒的CMV啟動子，構(gòu)建含Egr-1啟動子重組載體pEer-pfn。經(jīng)測序證實(shí)重組質(zhì)粒pEgr-pfn中Egr-1p序列是完全正確的。在脂質(zhì)體作用下將pEer-pfn質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用x線照射誘導(dǎo)穿孔素表達(dá)。轉(zhuǎn)染pEer-pfn的COS7細(xì)胞可檢出pfn mRNA，但用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測未見蛋白的表達(dá)。 二、人精子蛋白17基因的放射誘導(dǎo)表達(dá) 精子蛋白17(Sperm protein 17，Sp17)是

6、一種保守的睪丸特異性蛋白，其功能主要是促進(jìn)受精。近年發(fā)現(xiàn)該蛋白基因在一些惡性腫瘤組織中被激活并高水平表達(dá)，是一種新的癌瘤-睪丸(cancer-testis，CT)抗原。sp17在正常組織中局限性表達(dá)和在惡性組織中異常表達(dá)，使其在腫瘤診斷和治療中具有潛在價(jià)值，有望成為腫瘤診斷的標(biāo)志和免疫治療的靶點(diǎn)，尤其是對于女性腫瘤患者。為了利用sp17作為靶標(biāo)進(jìn)行婦科腫瘤體內(nèi)分子影像定位診斷和磁致過熱治療的實(shí)驗(yàn)研究，需要建立表達(dá)Sp17蛋白的卵巢癌細(xì)胞

7、模型和動物模型，但目前尚無高表達(dá)sp17的卵巢癌細(xì)胞系。因此，我們擬通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Sp17 eDNA導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞系H08910，建立高表達(dá)sp17蛋白的卵巢癌細(xì)胞模型。同時(shí)用Egr-1啟動子替換表達(dá)載體的CMV啟動子，進(jìn)一步驗(yàn)證放射誘導(dǎo)基因表達(dá)的可行性。 1.構(gòu)建人精子蛋白17放射誘導(dǎo)表達(dá)載體。以pMD18T-Sp17質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)Sp17基因的上下游引物，在其兩端分別引入Nhe I和Kpn I酶切位點(diǎn)，經(jīng)Nhe I、

8、Kpn I雙酶切消化的Sp17基因和pEgr-pfn質(zhì)粒連接構(gòu)建成pEgr-Sp17重組質(zhì)粒。pEer-sp17重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果證實(shí)Sp17基因序列完全正確，成功構(gòu)建pEgr-Sp17質(zhì)粒。 2.人精子蛋白17在卵巢癌H08910中的穩(wěn)定表達(dá)。將重組質(zhì)粒pEer-sp17轉(zhuǎn)染人卵巢癌H08910細(xì)胞，用2Gy X線照射，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Sp17蛋白。在確證Sp17能瞬時(shí)表達(dá)后，繼續(xù)用含G41