穿孔素基因啟動子的克隆及體外區(qū)域性高甲基化.pdf

1、目的：我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：活動期SLE患者外周血中CD4<'+>T細(xì)胞穿孔素mRNA的表達(dá)和蛋白的含量明顯的增高，同時也發(fā)現(xiàn)CD4<'+>T細(xì)胞穿孔素基因啟動子區(qū)域出現(xiàn)了低甲基化。進(jìn)而用DNA甲基化抑制劑5-雜氮胞苷(5-azaC)處理正常CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞后，穿孔素的表達(dá)都有顯著的增高，這種增高與CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞穿孔素基因啟動子區(qū)域出現(xiàn)的低甲基化有關(guān)。那么DNA高甲基化是否會使穿孔素表達(dá)下調(diào)呢?

2、 本實驗擬克隆穿孔素基因啟動子區(qū)域(PRF1)，并對PRF1進(jìn)行體外區(qū)域性高甲基化，為探討穿孔素基因調(diào)控序列高甲基化能否引起穿孔素表達(dá)下調(diào)奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)以人全基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增方法獲得穿孔素基因啟動子區(qū)域(PRF1)。(2)將PRF1克隆到T載體，雙酶切鑒定并測序證實：再定向亞克隆至報告基因載體pGL3-Basic中。(3)大量酶切得到目的片斷，用甲基化酶M.SssI及甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S