受體分子CD44介導(dǎo)寡糖透明質(zhì)酸調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探索在CD44受體分子介導(dǎo)下，寡糖透明質(zhì)酸（oligosaccharides of hyaluronan,o-HA）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，以進(jìn)一步從分子水平了解o-HA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制。 方法：1. 用I型膠原酶消化分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），建立人血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)。以光鏡觀察，DiI-Ac-LDL染色，F(xiàn)VIII相關(guān)

2、抗原免疫熒光染色和CD31流式檢測(cè)的方法進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)鑒定。2. 免疫熒光法檢測(cè)HUVEC CD44的表達(dá)和分布；建立原代細(xì)胞RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術(shù)，用電擊轉(zhuǎn)染的方法將siRNA導(dǎo)入HUVEC中，利用Real time PCR和Western blot方法分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)CD44的表達(dá)。3. 將o-HA分別作用于siRNA-CD44干擾和陰性siRNA干擾的HUVEC，進(jìn)行細(xì)胞增殖和血管

3、形成實(shí)驗(yàn)，觀察CD44干擾與未干擾細(xì)胞在增殖與血管枝形成現(xiàn)象上的差異，并進(jìn)一步通過(guò)Western blot和PCR方法分別檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)分子Src、FAK、ERK1/2和早期反應(yīng)基因(early response genes，ERGs)c-JUN、c-FOS的改變，以探討CD44在介導(dǎo)o-HA促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用機(jī)理。 結(jié)果：1. 原代培養(yǎng)細(xì)胞10天左右可長(zhǎng)成單層，多角形，呈鋪路石樣排列，DiI染色、FVIII相關(guān)抗原免疫

4、熒光染色均呈陽(yáng)性，細(xì)胞表面CD31表達(dá)率為98.3％，證實(shí)此細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。2. 免疫熒光染色證實(shí)，體外培養(yǎng)的HUVEC表達(dá)CD44，且在細(xì)胞表面和胞質(zhì)內(nèi)均能被檢測(cè)到。采用電轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾的方法干擾CD44分子，mRNA及蛋白水平干擾率鑒定結(jié)果顯示，三對(duì)siRNA-CD44中有兩對(duì)干擾率>70％，電擊轉(zhuǎn)染72h后蛋白水平干擾效應(yīng)最佳，干擾率為86.5％±2.0％。3. 10μg/mLo-HA能促進(jìn)HUVEC增殖和血管枝形成，激活Src、FAK

5、和ERK1/2激酶活性，上調(diào)c-JUN、c-FOS基因表達(dá)。以上作用均可不同程度被siRNA-CD44干擾所抑制。 結(jié)論：1.電擊轉(zhuǎn)染是對(duì)原代培養(yǎng)HUVEC進(jìn)行siRNA干擾的一種有效方法。2.HUVEC高表達(dá)CD44，分布在HUVEC表面和胞漿內(nèi)。3.CD44受體分子的作用可能通過(guò)激活Src、FAK、ERK信號(hào)通路途徑而發(fā)揮，進(jìn)一步誘導(dǎo)早期反應(yīng)基因c-iun、c-FOS上調(diào)，從而介導(dǎo)o-HA對(duì)HUVEC的增殖和血管形成功能。國(guó)