Rab5介導(dǎo)的β-AR囊泡運輸調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的機制.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合癥早期特征是肺微血管內(nèi)皮細胞(PMECs)損傷后通透性增高,肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚大量的水腫液,肺微血管內(nèi)皮完整性是治療和預(yù)防發(fā)生ARDS的重要環(huán)節(jié)。Beta-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptorβ-AR)在調(diào)控內(nèi)皮細胞過程中發(fā)揮重要作用。β-ARs具有三種亞型,β1-AR和β2-AR主要在心臟、肺臟等重要臟器血管系統(tǒng)發(fā)揮一定的作用,而β3-AR主要與脂肪組織相關(guān)。受體信號通路的激活與受體的內(nèi)吞、脫

2、敏、循環(huán)和降解等密切相關(guān),任何影響這些過程的因子都可能對內(nèi)皮細胞的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們既往研究表明Rab1可調(diào)節(jié)β-AR在細胞膜上的表達,從而調(diào)控LPS損傷肺微血管內(nèi)皮細胞過程的機制,為臨床藥物干預(yù)提供了新的靶點和策略。
　　Rab5作為Ras超家族的一個成員,主要有Rab5a、Rab5b和Rab5c三種亞型,研究最多的是Rab5a。在HEK293、cos-1等細胞,Rab5主要調(diào)控細胞囊泡從細胞膜向早期內(nèi)涵體的錨定和融合,同時

3、其介導(dǎo)的內(nèi)吞過程可能參與激動劑誘導(dǎo)的受體下調(diào)。但是,在肺微血管內(nèi)皮細胞,Rab5介導(dǎo)β-ARs的內(nèi)吞和下調(diào)的機制以及對屏障功能和通透性的調(diào)控作用尚未研究。
　　本實驗利用LPS處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞,模擬急性呼吸窘迫綜合癥的細胞病理,轉(zhuǎn)染野生型和負性突變體的Rab5a以及小干擾RNA,研究了Rab5a調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細胞β-AR胞內(nèi)運輸、膜上的表達、內(nèi)吞和下調(diào)等過程的機制,同時,研究了β-AR信號通路的激活與內(nèi)皮細胞緊密連接和粘

4、附連接的調(diào)控關(guān)系,以及Rab5a如何參與調(diào)控β-AR信號通路調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能及滲透性。
　　研究方法:
　　1.采用原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)大鼠PMECs,并對其進行綜合鑒定:CD34、BSI、Ⅷ因子,同時觀察各代細胞的結(jié)構(gòu)和亞結(jié)構(gòu)。
　　2.實時細胞監(jiān)測儀iCELLigence系統(tǒng)對細胞屏障功能進行實時監(jiān)測。
　　3.運用Western Blot檢測LPS處理RPMECs后occludin蛋白和VE-cad

5、herin蛋白在膜和漿內(nèi)表達情況。
　　4.應(yīng)用熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染Rab5a WT、Rab5a S34N、Rab5a siRNA后β2腎上腺素受體在細胞內(nèi)的亞定位。
　　5.應(yīng)用內(nèi)吞實驗和下調(diào)實驗檢測轉(zhuǎn)染Rab5a WT、Rab5a siRNA后β2腎上腺素受體的內(nèi)吞和下調(diào)變化。
　　6.運用ELISA法檢測RPMECs經(jīng)LPS處理以及轉(zhuǎn)染Rab5a siRNA后監(jiān)測細胞指數(shù)改變。
　　研究結(jié)果:
　　1.

6、綜合鑒定結(jié)果顯示:CD34,Ⅷ因子和BSI結(jié)合試驗陽性,電鏡下可見細胞膜,細胞核,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),線粒體及溶酶體等亞結(jié)構(gòu)。
　　2. LPS處理RPMECs后細胞指數(shù)呈時間和濃度依賴形式降低,屏障功能在6-8h之間破壞最明顯。同時,occludin蛋白和VE-cadherin蛋白在膜上的表達顯著降低。β2腎上腺素受體激活能減弱細胞指數(shù)的降低程度,同時也能抑制兩種連接蛋白的減低。
　　3.正常情況下,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激動

7、劑ISO后,主要聚集在胞漿;轉(zhuǎn)染Rab5a WT后,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激動劑ISO后,主要聚集在胞漿;轉(zhuǎn)染Rab5a siRNA后,β2-AR主要聚集在胞膜,加入激動劑ISO后,仍然聚集在胞膜。
　　4.轉(zhuǎn)染Rab5a S34N和Rab5a siRNA后,膜表面β-AR分別增加23.9％和28.3%,β2-AR分別增加32.1%和35.6%,轉(zhuǎn)染Rab5a WT無明顯改變。LPS處理RPMECs后β2-AR降低42%,

8、可被Rab5a S34N和Rab5a siRNA分別提高39%和37%。
　　5.[3H]-CGP12177誘導(dǎo)的受體內(nèi)吞在30min時達到最高,Rab5a siRNA顯著抑制內(nèi)吞速率;Rab5a WT無明顯作用。ISO誘導(dǎo)的受體下調(diào)在16h達到最低,Rab5a siRNA顯著抑制受體下調(diào);Rab5a無明顯作用。
　　6.Rab5a基因下調(diào)后對內(nèi)皮屏障功能無明顯改變,但轉(zhuǎn)染后加入激動劑ISO或ISO/Atenolol后,LP