APE1在氧化應(yīng)激介導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　本研究從細(xì)胞水平上觀察H2O2對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用和APE1表達(dá)的影響;了解APE1表達(dá)上調(diào)后對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷細(xì)胞的影響，從反面論證APE1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的是否有調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)體外分離培養(yǎng)鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml后培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，以不同濃度H2O2刺激培養(yǎng)細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ROS的產(chǎn)生、細(xì)

2、胞增殖情況以及APE1的表達(dá);
　　(2)然后構(gòu)建攜帶APE1基因的慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)APE1的表達(dá)，觀察APE1表達(dá)上調(diào)后對(duì)H2O2介導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生及細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:
　　一、H2O2對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖反應(yīng)、ROS產(chǎn)生以及APE1表達(dá)的影響
　　(1) MTT法結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，H2O2濃度為50umol/L刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h，OD值為0.211±0.002

3、，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖反應(yīng)無明顯改變，P＞0.05，差異無顯著意義，當(dāng)H2O2濃度為100umol/L，200umol/L，OD值分別為0.158±0.002，0.099±0.001，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖反應(yīng)低下(P＜0.05)，且200umol/L的H2O2比100umol/L抑制細(xì)胞的增殖反應(yīng)更明顯(P＜0.05);而采用DCF平均熒光強(qiáng)度值表示細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，當(dāng)H2O2濃度為50umol/L，熒光強(qiáng)度為68.07±1.40，與對(duì)照

4、組比較無明顯差異(P＞0.05)，當(dāng)濃度為100umol/L，200umol/L，熒光強(qiáng)度分別為87.46±1.89，101.79±1.56，呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)，且200umol/L比100umol/L的H2O2引起細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多更加明顯(P＜0.05)。用100umol/L H2O2刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞24h、48h、96h，OD值分別為0.161±0.002，0.103±0.001，0.067±0.004，與對(duì)照組比較，細(xì)

5、胞的增殖反應(yīng)低下(P＜0.05)，而48h的細(xì)胞增殖反應(yīng)比24h有下降(P＜0.05)，96h比48h細(xì)胞增殖反應(yīng)低下，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與此同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，測(cè)得的DCF熒光強(qiáng)度分別為82.33±0.72，93.93±0.30，102.93±0.95，呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)，而胞內(nèi)生成的ROS在48h較24h增加(P＜0.05)，96h生成的ROS比48h增多，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈時(shí)效、量效關(guān)系。

6、　　(2)與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加及刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Western blot檢測(cè)APE1蛋白的表達(dá)受抑制(P＜0.05)，同樣具有時(shí)效、量效關(guān)系。
　　二、APE1對(duì)H2O2介導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用
　　(1)與對(duì)照組及空載體組相比，Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，攜帶APE1基因的慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，能夠上調(diào)APE1的表達(dá)(P＜0.05);
　　(2)與對(duì)照組相比較，H2O2組ROS（

7、熒光強(qiáng)度為86.40±1.19）產(chǎn)生顯著增加(P＜0.05)、增殖反應(yīng)（OD值為0.153±0.001）下降(P＜0.05);與H2O2組比較，H2O2+LV-GFP組ROS生成（熒光強(qiáng)度為83.23±0.98）及增殖能力（OD值0.154±0.002）無顯著改變，APE1過表達(dá)后，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖反應(yīng)（OD值為0.209±0.001）抑制情況顯著改善(P＜0.05)，而ROS生成（熒光強(qiáng)度為66.79±1.32）顯著降低(P＜0.0