人血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷中的作用研究.pdf

1、心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是一系列涉及循環(huán)系統(tǒng)的疾病，其發(fā)病率占全球總發(fā)病率的三分之一以上，更是發(fā)達國家最為主要的死亡原因，在發(fā)展中國家的死亡率也逐年遞增。心血管疾病的發(fā)生常常與動脈硬化有關(guān)。
　　 動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病。隨著我國人民生活水平提高和飲食習慣改變，該病也成為我國的一個主要死亡原因。AS的發(fā)病機制復雜，一般認為該

2、病是多種因素長期共同作用的結(jié)果，其中氧化應激是AS 斑塊形成學說中的重要組成部分，活性氧族（reactive oxygen species, ROS）大量生成導致的內(nèi)皮細胞(endotheliAlcells, Ecs)功能性損傷是AS 發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。
　　 大豆異黃酮（soy isoflavone,SI）是天然存在于豆科植物中，在豆類生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物，屬于黃酮類化合物的一種，因與雌激素有相似的結(jié)構(gòu)，而被稱為植物雌激

3、素。Si具有廣泛的生物學效應，如抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松、改善更年期癥狀、治療心血管疾病等多方面效應，體內(nèi)實驗表明其具有抗動脈粥樣硬化效應。染料木黃酮（Genistein, Gen）是SI在人體內(nèi)的主要存在形式，也是研究最多的SI，大量有關(guān)SI的體內(nèi)外實驗都是圍繞Gen 展開的。流行病學證據(jù)顯示有攝食大豆制品傳統(tǒng)的亞洲國家特別是中國和日本CVD 發(fā)病率遠低于歐美國家，進一步研究發(fā)現(xiàn)亞洲人血清中的Gen 可達300nmol/L，遠遠高于沒有食

4、用豆制品習慣的歐美人血清中Gen的水平（6 nmol/L）。
　　 但是，有關(guān)Gen抗AS的分子機制尚不清楚。過氧化酶體增殖物激活受體（peroxisomeproliferators-activated receptor gamma, PPARγ）是核受體超家族中的一員。近期研究發(fā)現(xiàn)PPARγ活化后可改善內(nèi)皮功能。由此，我們推測，Gen是通過活化PPARγ來保護內(nèi)皮細胞并進一步達到抗AS的效果。
　　 基于上述分析，結(jié)合

5、國內(nèi)外研究進展，本研究以人血管內(nèi)皮細胞株EA.hy926為研究對象，首先建立以叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）誘導的氧化應激損傷體外模型，然后以Gen和t-BHP對EA.hy926內(nèi)皮細胞株進行單獨和聯(lián)合處理，通過CCK-8、熒光染色法（fluorescent staining）和流式細胞儀觀察Gen對內(nèi)皮細胞的活性及凋亡的影響，并運用蛋白免疫印跡（Western blot，WB）檢測Cas

6、pase-3的表達變化；另外以Gen對EA.hy926內(nèi)皮細胞株進行處理，運用蛋白免疫印跡、免疫細胞化學（immunohistochemistry，IHC）以及Real-time PCR等實驗方法，觀察Gen對EA.hy926中PPARγ蛋白表達以及核轉(zhuǎn)位的影響，并運用CCK-8 法檢測抑制劑GW9662對PPARγ
　　 保護內(nèi)皮細胞凋亡的影響，旨在揭示PPARγ在大豆異黃酮抑制氧化應激誘導人血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用。

7、　　 主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.利用t-BHP 建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926的體外氧化應激損傷模型。按梯度向接種的細胞中加入不同濃度的t-BHP，CCK-8 法檢測發(fā)現(xiàn)，t-BHP能明顯抑制EA.hy926的生長，至最大濃度240μmol/L時，抑制率達到（93.66±4.66）％，半數(shù)抑制濃度（IC50）為100μmol/L；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在EA.hy926的細胞核區(qū)域出現(xiàn)明顯的凋亡小體；

8、>　　 2.按梯度向接種的細胞中加入不同濃度的Gen，CCK-8 法測定后發(fā)現(xiàn)Gen能顯著抑制t-BHP 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，并呈明顯的劑量-效應關(guān)系，500nmol/L時，預處理組的細胞保護率為33.11％，流式細胞儀檢測亦發(fā)現(xiàn)此時總凋亡率為12.20％，與對照組相比，P＜0.05；Western blot 檢測結(jié)果表明Gen能明顯抑制Caspase-3的表達，且在500nmol/L時抑制程度達到最高；
　　 3.預制細胞爬

9、片，加入500nmol/L的Gen 預處理10h，進行免疫細胞化學檢測，與對照組相比，EA.hy926的PPARγ表達向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；提取細胞總蛋白、細胞核蛋白以及細胞漿蛋白，通過Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)在1～16 h內(nèi)，總蛋白中PPARγ的表達水平隨著Gen 處理時間延長逐漸增加，至4 h 達到最高，尤其表現(xiàn)在細胞核蛋白的檢測中，而在細胞漿蛋白的檢測中，PPARγ的表達量并無明顯的水平差異；通過PCR 檢測，經(jīng)過Gen 處

10、理，PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平的表達也明顯增高；
　　 4.向接種的細胞中加入PPARγ的抑制劑GW9662 處理24 h，經(jīng)過CCK-8 法檢測，發(fā)現(xiàn)細胞活力明顯低于Gen 預處理組，GW9662 有效的削弱了Gen對t-BHP 誘導的細胞損傷的保護作用。
　　 綜合上述實驗結(jié)果，得出全文結(jié)論，染料木黃酮可以顯著抑制叔丁基過氧化氫造成的細胞凋亡，并最終達到對t-BHP 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡有保護效應，這一保護效應可能是通過促進