螺旋藻激酶對血管內皮細胞氧化損傷保護作用的研究.pdf

1、采用過氧化氫(H2O2)誘導內皮細胞發(fā)生氧化應激的方法，建立人臍靜脈內皮細胞(HUVECS)氧化損傷模型，探討螺旋藻激酶(SPK)對內皮細胞內氧化還原體系的影響，及其對內皮細胞的單層細胞通透性和細胞粘附性的影響，推測螺旋藻激酶與動脈粥樣硬化之間的關系。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)HUVECS，檢測不同濃度H2O2和SPK對HUVECS細胞活力的影響，確定過氧化損傷模型所需H2O2濃度和藥物干預所使用的SPK濃度;
　

2、　2.建立內皮細胞氧化損傷模型并隨機分組，按添加藥物不同設計為6組:
　　N，正常組;
　　D，損傷組(2mmol·L-1H2O2);
　　E，陽性組（10μg·ml-1VitE+2mmol·L-1H2O2）;
　　L，低劑量組(1mg·ml-1 SPK+2mmol·L-1H2O2);
　　M，中劑量組（2mg·ml-1 SPK+2mmol·L-1H2O2）;
　　H，高劑量組(3mg·ml-1 SP

3、K+2mmol·L-1H2O2)。
　　3.測定單層細胞透過率T，得出H2O2及SPK對內皮細胞活力的影響及其對單層細胞通透性的影響，收集細胞培養(yǎng)上清液，超聲破裂法獲得細胞裂解液，用各種呈色反應檢測細胞培養(yǎng)液中一氧化氮體系里NO、NOS的含量，氧化還原體系中氧化還原酶SOD、GSH-PX的活性，細胞內MDA、ATP含量，細胞外LDH滲出量，酶聯(lián)免疫法測各組細胞培養(yǎng)液中ICAM-1的含量。
　　結果:
　　1、不同濃度H

4、2O2對HUVECS活力的影響
　　與正常組相比，H2O2濃度為1mmol/L時，對細胞活力的影響微弱并且不隨時間變化(P＞0.05); H2O2濃度為2mmol/L時，培養(yǎng)4小時后細胞抑制率超過40％，(P＜0.05)隨著時間延長抑制率增強，呈不可逆的損傷;H2O2濃度增大到4mmol/L、8mmol/L后，在最初的4小時抑制率即可達到60％以上(P＜0.01)，可見細胞成片脫落，細胞破碎漂浮在培養(yǎng)基表面。
　　2、SPK

5、對HUVECS活性的影響
　　隨著SPK濃度增大，其對細胞活力的影響從促進轉為抑制。與正常組對比，在SPK濃度達到2mg/ml時細胞活力最大;SPK濃度≥6mg/ml后，對細胞生長呈抑制作用。對比損傷組，中劑量組和高劑量組細胞活力明顯上升。
　　3、SPK對氧化損傷內皮細胞的單層細胞通透性的影響
　　與正常組相比，損傷組細胞的單層細胞通過率升高了6倍以上，(362.49±26.94 VS54.81±12.46);而與損

6、傷組比較，陽性組則使通透率減弱了60％以上(133.52±36.61 VS362.49±26.94)，SPK各濃度組對氧化造成的細胞單層通透性增強也表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且這種作用隨藥物濃度的增大而增強，(275.13±20.46 VS206.16±33.53 VS118.41±24.16)。
　　4、SPK對氧化損傷內皮細胞培養(yǎng)液中NO、NOS含量的影響
　　與正常組相比較，H2O2氧化損傷使內皮細胞分泌NO量明顯降低，(

7、P＜0.05);與損傷組相比較，除低劑量組外，Vitamin E和SPK均能使NO分泌量增加，且Vitamin E使NO升高的作用更明顯。
　　在NOS含量方面，各組間兩兩比較的數(shù)據差異均無顯著性，與正常組相比，損傷組的細胞培養(yǎng)液中NOS含量稍有升高(P＞0.05);與損傷組對比，低中高濃度組細胞培養(yǎng)液中NOS含量呈下降趨勢(P＞0.05)。
　　5、SPK對氧化損傷內皮細胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活性，細胞內MDA含量

8、的影響
　　與正常組比較，損傷組中SOD、GSH-PH兩種氧化還原酶的活性均明顯下降，脂質過氧化產物MDA含量明顯上升;與損傷組比較，陽性組及SPK各濃度組對SOD及GSH-PX的活性均明顯上調，而MDA含量則明顯下降;此種改變在SOD/MDA的比值上體現(xiàn)的更加明顯。
　　6、SPK對氧化損傷內皮細胞內ATP含量及LDH滲出量的影響
　　與正常組細胞相比，損傷組細胞的ATP含量明顯下降(P＜0.05)，而細胞LDH滲出

9、量明顯增加;對比損傷組，陽性組和SPK各濃度組的ATP含量均明顯上升，細胞LDH滲出量均降低，且此趨勢與SPK的濃度呈劑量效應關系。
　　7、SPK對氧化損傷內皮細胞培養(yǎng)上清液中ICAM-1含量的影響
　　與正常組相比，H2O2氧化刺激可使內皮細胞ICAM-1分泌量增多，達正常細胞的2.3倍，陽性對照組和SPK組與H2O2損傷組比較，ICAM-1含量明顯下降，且高濃度的SPK效果強于VitE。
　　結論:SPK可以拮抗