從“絡(luò)”論治缺血性腦損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、中風(fēng)病因其高發(fā)病率，高死亡率，高致殘率，而成為醫(yī)藥界的重點(diǎn)攻克項(xiàng)目。中醫(yī)在中風(fēng)病認(rèn)識(shí)及治療上有幾千年歷史，近年來(lái)，在臨床及實(shí)驗(yàn)研究方面已取得了可喜成就，但仍有許多問(wèn)題亟待進(jìn)一步解決。 王永炎院士認(rèn)為，以毒邪和病絡(luò)作為深入研究的切入點(diǎn)，是進(jìn)一步提高腦血管疾病療效的突破口所在?，F(xiàn)代研究已認(rèn)識(shí)到血管內(nèi)皮不僅僅是血液與組織間物質(zhì)交換的屏障，而且是一個(gè)重要的內(nèi)分泌、旁分泌器官，具有強(qiáng)大的分泌、代謝功能。與既往的腦缺血離體實(shí)驗(yàn)中多以神經(jīng)細(xì)胞

2、為研究目標(biāo)不同，我們以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)做為研究的切入點(diǎn)，從一個(gè)全新的角度研究藥物防治缺血性腦損傷進(jìn)行了有意義的探索，對(duì)于指導(dǎo)腦系疾病的中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究具有重要啟示。 本課題研究用藥為通絡(luò)救腦(TLJN)注射液，是治療缺血性腦病的中藥新藥。已完成驗(yàn)收的“十五”國(guó)家攻關(guān)課題“通絡(luò)救腦注射液臨床前研究”在保護(hù)大鼠腦缺血組織損傷中獲得了優(yōu)良效果，并在“863”項(xiàng)目支持下的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步肯定了其抗缺血損傷的效應(yīng)。我們從“絡(luò)脈”

3、功能調(diào)控入手，以神經(jīng)血管單元(NVU)做為一研究體系，從細(xì)胞、分子及基因水平進(jìn)一步研究TLJN注射液“解毒通絡(luò)”的藥效機(jī)制。以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞做為研究的切入點(diǎn)和樞紐，開展了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的藥理學(xué)研究，旨在從理論與方法學(xué)兩方面對(duì)現(xiàn)有的腦系疾病防治研究進(jìn)行有意義的補(bǔ)充和積極的探索。 實(shí)驗(yàn)方案共分三個(gè)部分： 第一部分：系基礎(chǔ)研究，原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rCMEC)，并做氧糖剝奪(OGD)缺血模型，觀察了TLJ

4、N注射液對(duì)其的保護(hù)效應(yīng)及可能的黏附機(jī)制研究。 第二部分：收集正常、缺血及藥物干預(yù)的最佳時(shí)段腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液，分別作用于正常、缺血及缺血再灌的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和皮層神經(jīng)元，研究生理及病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能改變，探討腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)血管單元(NVU)中另外兩種腦細(xì)胞的功能聯(lián)系。 第三部分：通過(guò)正常、缺血及TLJN干預(yù)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因芯片初探及部分差

5、異基因的進(jìn)一步驗(yàn)證，從整體基因表達(dá)水平來(lái)研究缺血對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及藥物對(duì)其的調(diào)控作用，進(jìn)一步深化“毒損腦絡(luò)”病機(jī)理論的生物學(xué)內(nèi)涵，詮釋TLJN“解毒通絡(luò)”的微觀作用機(jī)制全貌。 研究結(jié)果： 1.成功地培養(yǎng)和鑒定了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，掃描電鏡觀察可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞有豐富的微絨毛，透射電鏡觀察可見(jiàn)典型的緊密連接結(jié)構(gòu)，免疫組化對(duì)Ⅷ因子鑒定，其純度可達(dá)98％。 2.TLJN注射液對(duì)正常及缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)

6、作用，藥物劑量與細(xì)胞增殖活性呈非線性關(guān)系。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，可以肯定TLJN小劑量范圍(0.5～8μL·ML-1)均促進(jìn)了缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。 3.腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血6h時(shí)，E-選擇素和VCAM-1的表達(dá)均上調(diào)，提示CMEC缺血時(shí)啟動(dòng)了黏附機(jī)制。TLJN注射液干預(yù)缺血CMEC，能夠下調(diào)E-選擇素(P＜0.01)，而對(duì)VCAM-1影響不大。E-選擇素黏附機(jī)制的始動(dòng)因素之一，提示TLJ

7、N注射液可通過(guò)對(duì)E-選擇素這條通道的影響，抑制了黏附反應(yīng)的啟動(dòng)從而阻抑CMEC缺血損傷。 4.首次觀察分析了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CMECs-CM)中的活性物質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)元的生物學(xué)功能改變。通過(guò)乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)于缺血及缺血再灌這種病理狀態(tài)下的神經(jīng)元，各類腦微血管內(nèi)皮條件培養(yǎng)液都起到了一定的抗損傷效應(yīng)；而對(duì)正常神經(jīng)元卻表現(xiàn)為增加了LDH漏出率，即一定程度上增加了細(xì)胞膜損傷。再次通過(guò)細(xì)胞增殖活性的檢

8、測(cè)結(jié)果表明：N-CM、NT-CM及Rp-CM均抑制正常神經(jīng)元活性，而TLJN干預(yù)后的RT1-CM、RT2-CM無(wú)抑制效應(yīng)，并且高濃度的RT1-CM還能促進(jìn)正常神經(jīng)元的增殖活性，突顯出了TLJN通過(guò)CMEC介導(dǎo)的抗缺血性腦損傷效應(yīng)；CMEC的Is-CM及IsT-CM均能提高缺血損傷神經(jīng)元的細(xì)胞活性；N-CM與NT-CM均能夠促進(jìn)缺血再灌神經(jīng)元的活性，Rp-CM對(duì)缺血再灌神經(jīng)元的細(xì)胞活性效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TLJN干預(yù)后的RT1-CM、RT

9、2-CM卻均表現(xiàn)出提高缺血再灌神經(jīng)元的活性，體現(xiàn)了TLJN通過(guò)CMEC介導(dǎo)的保護(hù)缺血性腦細(xì)胞損傷的生物學(xué)效應(yīng)。 5.以NVU為一研究體系，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞做為藥物靶細(xì)胞，同步培養(yǎng)和研究了NVU三種主要細(xì)胞即腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，在三種狀態(tài)即正常、缺血及缺血再灌時(shí)的功能聯(lián)系。結(jié)果表明，在同一生理或病理情況下，內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)表現(xiàn)了中心環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控作用，無(wú)論是正常、缺血或是缺血再灌三種狀態(tài)，同一種CMEC分泌的活性物

10、質(zhì)對(duì)神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)卻表現(xiàn)出了高度的一致性；對(duì)比同一生理或病理的狀態(tài)下，無(wú)藥物干預(yù)與有TLJN干預(yù)的CMECs-CM對(duì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)差別，亦發(fā)現(xiàn)了許多共性結(jié)果。如在正常生理情況下，未表現(xiàn)出TLJN注射液的藥物優(yōu)勢(shì)。但是在涉及病理情況時(shí)，其生物學(xué)效應(yīng)均表現(xiàn)了有TLJN干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液明顯比無(wú)藥物作用的條件培養(yǎng)液具有抗缺血性腦損傷或保護(hù)腦細(xì)胞的功能效應(yīng)。從細(xì)胞生物學(xué)水平驗(yàn)證了TLJN是通過(guò)“解毒通絡(luò)”

11、的作用機(jī)制發(fā)揮了糾正腦細(xì)胞病理狀態(tài)的藥物效應(yīng)。 6.首例開展了正常、缺血及TLJN注射液干預(yù)的離體rCMEC的整體基因表達(dá)譜研究，獲得了大量的珍貴原始生物學(xué)信息。研究缺血與正常細(xì)胞的極顯著差異基因，從細(xì)胞功能構(gòu)成部位及分子生物學(xué)功能兩方面進(jìn)行了初步歸類。在已知的生物功能信息中，以參與酶活性、胞外分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、受體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等生物學(xué)功能居于前位。 7.篩選出TLJN干預(yù)缺血腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后有興趣的3條差異基因，通