高表達ACE2的MSC對ALI肺微血管內(nèi)皮細胞和肺損傷的修復作用及機制研究.pdf

1、文章分為以下幾部分進行論述：
　　第一部分 慢病毒介導的高表達ACE2的MSC細胞株的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建慢病毒介導的長期穩(wěn)定高表達血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(Angiotensin-converting enzyme2，ACE2)的小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstem cells，MSC)細胞株。
　　方法:(1)采用貼壁法原代分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠骨髓來源的MSC，并通過倒置顯微鏡觀察細胞形

2、態(tài)、流式細胞學檢測表面標志物和誘導成脂、成骨分化對其進行鑒定。(2)采用第三代自身滅活的免疫缺陷病毒作為慢病毒表達載體骨架，人翻譯延長因子1A作為啟動子，利用Gateway克隆技術(shù)通過BP重組反應(yīng)構(gòu)建pDown-mACE2，然后通過LR重組反應(yīng)將ACE2基因克隆人慢病毒表達載體中獲得高表達ACE2的慢病毒表達載體pLV.EX3d.P/neo-EF1A＞ mACE2＞IRES/eGFP，與ACE2基因共表達的增強型的綠色熒光蛋白(eGFP

3、)作為報告基因，表達載體在另外三個輔助質(zhì)粒:pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5輔助下在293FT細胞中進行包裝，獲得滴度較高的慢病毒，將重組慢病毒轉(zhuǎn)染4-7代的MSC，用G418進行抗藥基因塞選純化，從而獲得純度較高的攜帶了eGFP和ACE2的MSC(MSC-ACE2)及僅攜帶了eGFP的空白對照MSC(MSC-GFP)，通過熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測MSC在轉(zhuǎn)染后以及穩(wěn)定傳代30代

4、以上后的eGFP表達陽性率以評估MSC的轉(zhuǎn)染效率。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后MSC的ACE2基因和蛋白表達水平，用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后MSC培養(yǎng)基中可溶性ACE2蛋白的表達。(3)通過體外誘導MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2向脂肪細胞、骨細胞分化，評估基因轉(zhuǎn)染對MSC多項分

5、化潛能的影響;MTT法比較MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2增殖能力，評估基因轉(zhuǎn)染對MSC增殖的影響; Transwell小室遷移實驗檢測MSC、MSC-GFP、MSC-ACE2的遷移能力，評估基因轉(zhuǎn)染對MSC遷移能力的影響。
　　結(jié)果:(1)成功分離培養(yǎng)原代C57BL/6小鼠骨髓來源的MSC，細胞呈長梭形，極性生長，生長旺盛;流式細胞學檢測MSC表形，MSC表達Sca-1、CD29、CD34、CD44，不表達CD117;多

6、項分化潛能檢測MSC可體外誘導分化為脂肪細胞和骨細胞。(2)慢病毒介導的高表達ACE2的MSC，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率高達95％以上，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)30代后，流式細胞儀檢查其轉(zhuǎn)染效率仍高達86％-94.3％;與未轉(zhuǎn)染的MSC相比，ACE2高表達的MSC其ACE2 mRNA水平、膜型ACE2蛋白及可溶性ACE2蛋白水平均顯著增高，分別是未轉(zhuǎn)染細胞的4倍、1.9倍和2.6倍（P值均＜0.05）。(3)ACE2基因轉(zhuǎn)染前后，MSC成骨成脂

7、分化、增殖、遷移能力均無顯著差異。
　　結(jié)論:慢病毒載體介導的ACE2基因轉(zhuǎn)染能高效轉(zhuǎn)染原代骨髓來源的MSC，轉(zhuǎn)染后的MSC可穩(wěn)定高表達ACE2蛋白，并且其成骨和成脂分化、增殖和遷移能力無明顯影響。
　　第二部分 高表達ACE2的MSC對脂多糖誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用的研究
　　目的:明確高表達ACE2的MSC(MSC-ACE2)對LPS損傷后肺微血管內(nèi)皮細胞(EC)活化的腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的抑制

8、效應(yīng)及其對損傷EC的保護作用。
　　方法:(1)在體外用100ng/ml LPS干預貼壁生長的EC，于0h、2h、4h、6h、12h、24h觀察其對EC衰老、內(nèi)皮通透性的影響，選擇恰當?shù)臅r間點以建立LPS誘導的EC損傷模型。(2)將損傷的EC與不同細胞進行間接共培養(yǎng)以評估MSC-ACE2對損傷EC的修復效應(yīng)及機制，分為以下五組:EC組、EC+LPS組、EC+LPS+MSC組、EC+LPS+MSC-GFP組和EC+LPS+MSC-A

9、CE2組。(3) ELISA法檢測培養(yǎng)基中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、血管緊張素1-7(Ang1-7)的水平，qRT-PCR檢測EC表面血管緊張素1型受體(AT1R)和AT2R的表達以評估MSC-ACE2對EC局部RAS的影響。通過流式細胞儀檢測EC凋亡、細胞衰老檢測以評估MSC-ACE2對EC活力的影響;通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測EC的ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6的mRNA水平和ELISA法檢

10、測培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6蛋白水平的表達以評估MSC-ACE2對EC炎癥介質(zhì)表達的影響;通過葡聚糖滲漏實驗檢測EC通透性、Western blotting檢測EC粘附連接VE-cadherin的表達、ELISA法檢測培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達以評估MSC-ACE2對EC通透性的影響及其可能的機制;
　　結(jié)果:(1)LPS刺激EC后可以導致EC衰老比例和EC通透性逐漸增加，并呈時間依賴性，與0h點相比，LPS干預

11、4h后細胞衰老比例增加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，LPS干預6h后內(nèi)皮通透性增高顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），本研究中采用LPS干預6h來建立EC損傷模型。(2) MSC-ACE2可顯著抑制LPS損傷后EC活化的RAS。與LPS損傷組比較，MSC-ACE2組培養(yǎng)基中AngⅡ的水平顯著降低，而AngⅡ的降解產(chǎn)物Ang1-7水平顯著增加，對EC表達AT1R和AT2R mRNA的表達無明顯影響;而MSC和MSC-GF

12、P組對上訴指標均無顯著影響。(3) MSC-ACE2可較MSC和MSC-GFP更好的減少LPS損傷后EC的早期凋亡[(6.93±0.53) vs.(13.91±0.77)&(13.38±1.59)，P＜0.05]和細胞衰老[(4.37±0.54) vs.(7.85±0.33)&(7.16±0.16)，P＜0.05]。(4)MSC-ACE2可抑制LPS損傷的EC炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。MSC和MSC-GFP與損傷EC共培養(yǎng)后，僅可降低損傷EC表面

13、ICAM-1 mRNA的表達，而MSC-ACE2組EC粘附分子ICAM-1、VCAM-1和促炎因子TNF-α、IL-6的mRNA水平和TNF-α、IL-6的蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）。(5) MSC-ACE2可顯著改善LPS損傷EC的屏障功能。葡聚糖滲漏實驗結(jié)果顯示MSC-ACE2可降低LPS損傷后EC通透性至正常水平，Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)MSC-ACE2組EC粘附連接VE-cadherin的表達水平顯著增

14、加，恢復正常，且培養(yǎng)基中VEGF表達水平也顯著降低至正常水平;MSC和MSC-GFP組對上訴指標均有改善的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:高表達ACE2的MSC可以抑制LPS損傷后肺微血管內(nèi)皮細胞局部RAS的活化，并通過降低損傷內(nèi)皮的凋亡和衰老、抑制損傷內(nèi)皮炎癥介質(zhì)的表達、恢復內(nèi)皮細胞功能。
　　第三部分 高表達ACE2的MSC移植對ALI的修復作用的研究
　　目的:明確高表達ACE2的MSC移植入急性肺損傷(A

15、LI)小鼠體內(nèi)可靶向抑制肺組織RAS的活化，修復微血管內(nèi)皮細胞、抑制肺組織炎癥，從而促進肺損傷修復。
　　方法:野生型(WT)和ACE2基因敲除(ACE2-/y)的C57BL/6小鼠隨機分為Control組(NS+PBS),ALI組(LPS+PBS), MSC-GFP組(LPS+MSC-GFP), ACE2組(LPS+MSC-ACE2)，氣道內(nèi)滴入LPS復制ALI小鼠模型，造模4h后按分組給予不同處理，24h和72h后(1)近紅外

16、活體、離體器官（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、胰腺）成像及肺組織熒光鏡檢評價MSC-ACE2細胞在損傷肺組織內(nèi)的靶向歸巢作用。(2)處死小鼠留取肺組織，Western blotting法和ELISA法檢測肺組織、肝臟、脾臟和血漿中ACE2蛋白的表達、ELISA法檢測肺組織內(nèi)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、Ang1-7的水平，證實ALI發(fā)生以后，肺組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，并明確高表達ACE2的MSC移植是否能在損傷肺組

17、織局部高表達ACE2蛋白及其對局部血管緊張素的調(diào)節(jié)作用。(3)計算肺濕重/體重比評價肺水腫程度;伊文思藍漏出實驗評價肺微血管內(nèi)皮通透性;電鏡觀察肺微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)及細胞間連接以評價肺微血管內(nèi)皮細胞的損傷程度;Western blotting檢測肺組織內(nèi)iNOS、eNOS的水平評價肺血管內(nèi)皮細胞的合成功能，從而綜合評價高表達ACE2的MSC對ALI小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的修復作用。(4)HE染色行組織病理學檢查并進行肺損傷評分以評價肺

18、損傷嚴重程度;留取肺泡灌洗液(BALF)，計數(shù)肺泡灌洗液中有核細胞總數(shù)和瑞氏染色進行中性粒細胞分類計數(shù)評價炎癥細胞的浸潤程度;ELISA法檢測肺組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-10的濃度評價肺部炎癥反應(yīng)的強度，從而綜合評價高表達ACE2的MSC對ALI小鼠肺組織失控炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)和肺損傷修復作用。
　　結(jié)果:(1)活體及離體器官成像結(jié)果顯示，高表達ACE2的MSC移植后30min在肺組織內(nèi)即可見明顯的熒光信號，在24h達

19、到高峰，72h有所降低;在72h肺組織熒光鏡檢也可見較多表達綠色熒光蛋白的MSC，心臟、腎臟、胰腺、腸道未見明顯熒光信號積聚，肝臟和脾臟隨著時間點延長熒光信號積聚有所增強。(2)高表達ACE2的MSC歸巢至損傷肺組織后，肺組織內(nèi)ACE2蛋白水平較MSC-GFP顯著增加，肝臟和脾臟組織中ACE2蛋白在移植后72h有增加趨勢，而血清中ACE2蛋白水平較前無明顯變化，;ALI發(fā)生后，損傷肺組織內(nèi)AngⅡ的水平較對照組顯著升高，Ang1-7的水

20、平明顯降低，AngⅡ的水平在ACE2-/y的ALI小鼠比野生型ALI小鼠增加更為顯著，MSC-GFP組AngⅡ水平有所降低，而ACE2高表達MSC治療組AngⅡ的水平下降較MSC-GFP組更加顯著，且Ang1-7的水平較ALI組和MSC-GFP治療組增加更顯著。(3)高表達ACE2的MSC移植可減輕LPS誘導的WT和ACE2-/y的ALI小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷。MSC-ACE2組與MSC-GFP組相比較能更顯著的減少肺濕重/體重比、降

21、低肺微血管內(nèi)皮對伊文思藍的通透性、恢復肺微血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)及細胞間連接;不僅如此，MSC-ACE2可顯著改善肺微血管內(nèi)皮合成iNOS、eNOS的功能。(4)高表達ACE2的MSC移植可減輕LPS誘導的WT和ACE2-/y的ALI小鼠肺病理損傷，抑制肺組織炎癥反應(yīng)。MSC-ACE2治療與MSC-GFP治療相比可顯著減輕肺損傷、降低肺損傷評分、BALF中有核細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)，并且能更有效的降低肺組織內(nèi)促炎介質(zhì)IL-1β、IL-6水