鈦表面透明質(zhì)酸微圖形調(diào)控血管內(nèi)膜形成的研究.pdf

1、心血管植入材料表面內(nèi)皮化被認(rèn)為是防止植入后血栓和內(nèi)膜增生的主要途徑，因此提高這類(lèi)生物材料的表面內(nèi)皮化質(zhì)量是非常重要和有意義的。目前，體外研究證明在生物材料表面覆蓋完整的內(nèi)皮層具有一定的抑制血栓形成和平滑肌細(xì)胞增生的作用。但是，這種材料表面單一細(xì)胞形成的內(nèi)膜植入體內(nèi)后，存在抗凝血功能不足和容易大面積脫落等問(wèn)題。為了解決這一問(wèn)題，更多的研究轉(zhuǎn)向如何實(shí)現(xiàn)體內(nèi)內(nèi)皮化，但對(duì)材料表面內(nèi)皮細(xì)胞周細(xì)胞環(huán)境和仿流體剪切力環(huán)境的構(gòu)建與改善的研究也不可缺少。

2、基于此，本文在構(gòu)建與改善材料表面內(nèi)皮細(xì)胞周細(xì)胞環(huán)境和仿流體剪切力環(huán)境的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了材料表面仿生內(nèi)膜構(gòu)建的相關(guān)研究。
　　本文采用具有較好生物相容性的鈦(Ti)作為基底材料，利用Ti表面透明質(zhì)酸(HA)條帶微圖形模擬體內(nèi)流體剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的拉伸力學(xué)作用;利用微圖形對(duì)平滑肌細(xì)胞(SMCs)的限制作用為內(nèi)皮細(xì)胞提供仿生的平滑肌周細(xì)胞環(huán)境;同時(shí)構(gòu)建了利用透明質(zhì)酸酶(HAa)水解HA以實(shí)現(xiàn)ECs和SMCs的有序共培養(yǎng)(SMCs

3、-HAa-ECs)和利用四型膠原(ColⅣ)屏蔽HA的阻抗效果以實(shí)現(xiàn)ECs和SMCs的有序共培養(yǎng)(SMCs-ColⅣ-ECs)兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，并在此基礎(chǔ)上初步實(shí)現(xiàn)了Ti金屬表面血管仿生內(nèi)膜構(gòu)建，同時(shí)對(duì)該內(nèi)膜的生物學(xué)功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。首先，研究了P10/40(HA條紋寬度10μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度40μm)、P25/25(HA條紋寬度25μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度25μm)、P40/10(HA條紋寬度4

4、0μm;裸露的堿活化Ti條紋寬度10μm)三種微圖形尺寸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、增殖、功能性因子分泌和抗凝血功能的影響，篩選出最適合臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生理功能發(fā)揮的微圖形尺寸。其次，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了“SMCs-HAa-ECs”和“SMCs-ColⅣ-ECs”兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。通過(guò)對(duì)比兩個(gè)模型中內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、抗凝血因子分泌功能、抗凝血功能以及抗切應(yīng)力功能，篩選出更適合Ti基底血管仿生內(nèi)膜的共培養(yǎng)模型。最后，在前一步篩選

5、的基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)平滑肌細(xì)胞初始種植密度的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了Ti表面血管仿生內(nèi)膜的初步構(gòu)建，并對(duì)構(gòu)建的仿生內(nèi)膜進(jìn)行了功能評(píng)價(jià)。綜合利用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、水接觸角分析、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光染色分析等方法對(duì)Ti表面透明質(zhì)酸微圖形的物化性能和穩(wěn)定性進(jìn)行了表征。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和免疫熒光染色分析方法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和分泌功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，尤其是運(yùn)用雙

6、染方法觀察共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和行為。運(yùn)用細(xì)胞形態(tài)測(cè)量和計(jì)算軟件(ImageJ)統(tǒng)計(jì)出內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)指數(shù)。通過(guò)血小板粘附和激活實(shí)驗(yàn)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、血漿凝血酶原時(shí)間(PT)實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞抗凝血功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在流動(dòng)腔裝置內(nèi)模擬人體主動(dòng)脈血流剪切力對(duì)材料表面內(nèi)皮細(xì)胞的抗剪切力功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　本文的另一個(gè)相關(guān)工作是結(jié)合Ti表面透明質(zhì)酸微圖形對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控和脫細(xì)胞技術(shù)在Ti基底上構(gòu)建了透明質(zhì)酸微

7、圖形和內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)交錯(cuò)分泌的表面，并對(duì)該表面進(jìn)行了纖維蛋白原變性、內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附與抗凝血功能、平滑肌細(xì)胞粘附和巨噬細(xì)胞粘附等生物相容性評(píng)價(jià)。
　　全文主要結(jié)果如下:
　　1、透明質(zhì)酸微圖形制備到Ti基底表面，該二維微圖形具備較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能穩(wěn)定性。P10/40、P25/25、P40/10三個(gè)尺寸的微圖形中P25/25更適合內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的發(fā)揮，包括形態(tài)仿生、功能性因子的分泌及抗凝血功能等。
　　2、透明質(zhì)酸微

8、圖形表面本身的血液相容性并不理想，但是通過(guò)微圖形調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，再結(jié)合脫細(xì)胞技術(shù)可獲得圖形化分布的內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)。初步生物學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，該細(xì)胞外基質(zhì)表面具有較好的抑制纖維蛋白原變性功能、促內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附、有序分布和抗凝血功能，抑制平滑肌細(xì)胞粘附和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞表型收縮功能，以及抑制巨噬細(xì)胞粘附的功能。
　　3、通過(guò)透明質(zhì)酸酶的加入可改變透明質(zhì)酸阻抗細(xì)胞粘附的作用，實(shí)現(xiàn)了“SMCs-HAa-ECs”共培養(yǎng)體系的

9、構(gòu)建;利用ColⅣ的引入屏蔽透明質(zhì)酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的阻抗作用，實(shí)現(xiàn)了“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)體系的構(gòu)建;通過(guò)兩套模型中內(nèi)皮細(xì)胞抗凝血因子的分泌、抗凝血功能、抑制平滑肌細(xì)胞增生功能和抗流體剪切力功能的綜合比較，發(fā)現(xiàn)“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)模型具有更大的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)。
　　4.在“SMCs-ColⅣ-ECs”共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，利用內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的初始種植密度差(1×105 cells/ml∶2.5×104 c