透明質(zhì)酸合成途徑在乳酸乳球菌中的建立及微生物合成透明質(zhì)酸分子量調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、透明質(zhì)酸（HA）作為一種高分子量的黏多糖，廣泛存在于脊椎動物細胞中，發(fā)揮著結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)和信號識別的功能。HA由于其優(yōu)異的黏彈性、保濕性和支撐作用，被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、藥物傳遞系統(tǒng)、疫苗和功能健康食品。目前，工業(yè)上主要經(jīng)由革蘭氏陽性C型鏈球菌如獸疫鏈球菌（Streptococcuszooepidemicus）發(fā)酵生產(chǎn)。但作為生產(chǎn)菌株，鏈球菌生長速度慢、培養(yǎng)基成本高等劣勢日益顯現(xiàn)出來，而尋找新的優(yōu)秀野生生產(chǎn)菌株的希望渺茫。所以，利

2、用基因工程構(gòu)建合成HA的工程菌株不但有利于克服鏈球菌作為發(fā)酵生產(chǎn)HA菌株的劣勢，而且對提高HA的品質(zhì)，擴大HA的應(yīng)用范圍具有理論意義和應(yīng)用價值。 乳酸乳球菌（Lactoccus lactis）作為革蘭氏陽性菌的模式生物，已被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵生產(chǎn)中，且被認定為GRAS微生物。乳酸乳球菌由于其自身的優(yōu)良特性，正越來越多地被應(yīng)用于代謝工程改造過的現(xiàn)代工業(yè)中。在過去的25年中，乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟，其中一系列的誘導(dǎo)表達啟動

3、子得到了深入的研究，并已開始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。通過改變小肽、單糖的濃度或誘導(dǎo)溫度等調(diào)控因子，這些啟動子能夠?qū)崿F(xiàn)乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表達。NICE系統(tǒng)是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系統(tǒng)之一，已被廣泛地應(yīng)用于該菌株的代謝工程改造。不但誘導(dǎo)劑乳酸鏈球菌素（nisin）是一種理想的高效安全無毒的食品級誘導(dǎo)分子，而且在NICE系統(tǒng)中可以將染色體上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有l(wèi)acF基因的質(zhì)粒結(jié)合使用，用食品級

4、篩選標記lacF替代抗生素抗性基因，構(gòu)建食品級表達系統(tǒng)，而且該方式構(gòu)建的工程菌株遺傳穩(wěn)定。為了改善現(xiàn)有HA生產(chǎn)菌株的不足，計劃利用該系統(tǒng)構(gòu)建既具有合成HA能力的，同時符合公認安全標準的乳酸乳球菌工程菌株。工程菌株NFHA03和NFHA02發(fā)酵液中HA的濃度分別為0.49 g/L和0.38g/L，前者大約高出后者33％。證明在乳酸乳球菌工程菌株中重組表達異源szHasA，同時超表達同源UDP-GlcDH和LACR較同時表達外源szHasA

5、、szHasB和szHasC更利于HA的合成。本論文利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng)，構(gòu)建得到一株不產(chǎn)生莢膜的具有食品級HA合成能力的工程菌株，而食品級HA在保健食品、醫(yī)藥產(chǎn)品和化妝品的應(yīng)用中具有明顯的優(yōu)勢。 HA的相對分子質(zhì)量（Mr）一般分布在104 Da～107 Da范圍內(nèi)。研究表明，在細胞和組織中，HA生物活性與糖鏈長度相關(guān)，不同Mr的HA具有不同甚至相反的生理或藥理作用，HA的多種生物活性具有Mr依

6、賴性。通過差異表達HA合成相關(guān)酶類，脊椎動物具有在體內(nèi)調(diào)控HA Mr的能力。而目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)的HA是Mr從大到小的一系列糖鏈的組合。因此，在活體微生物中確定HA的Mr調(diào)控機制并且建立制備特定Mr或特定Mr范圍分布的HA的方法，不但具有重要的理論意義，而且對擴展HA的應(yīng)用范圍、改良含HA產(chǎn)品的質(zhì)量具有應(yīng)用價值。體外實驗已證明，合成能力與底物濃度的比率是影響HA Mr的主要因素之一，認為這一理論同樣適用于活體微生物內(nèi)。為實現(xiàn)乳酸乳球菌工

7、程菌株中HA合成能力與底物濃度的比率的可控調(diào)節(jié)，本論文構(gòu)建了一個雙質(zhì)粒的調(diào)控表達系統(tǒng)，包括表達szllasA的載體pN28148-szHasA和表達szllasB的載體pN29531-szHasB，而這兩個質(zhì)?？晒泊嬗谕恢耆樗崛榍蚓?。pN28148-szHasA包含有乳酸乳球菌常用載體pSH71的復(fù)制起始位點，而szllasA基因位于NICE系統(tǒng)啟動子nisA的調(diào)控之下；而另一個載體pN29531-szHasB則含有另一個乳酸乳球菌

8、常用載體pAMb1所攜帶的復(fù)制起始位點，同時szllasB基因的誘導(dǎo)表達受到lacR啟動子的調(diào)控。蛋白表達結(jié)果證明在工程菌株NFHA04中，借助pN28148-szHasA和pN29531-szHasB組成的雙質(zhì)粒調(diào)控表達系統(tǒng)，實現(xiàn)了不同誘導(dǎo)條件下改變szHasA與szHasB之間表達水平比率的實驗?zāi)康摹zHasA和szHasB mRNA拷貝數(shù)之間的比率，表征著HA合成能力與HA底物合成能力之間的相對強弱。不同誘導(dǎo)條件下，分析szHa

9、sA/szHasB mRNA比率對乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量（Mw）的影響，在微生物體內(nèi)證明了HA合成能力與底物合成能力之間的相對強弱具有調(diào)控HA Mw的作用。當代表HAS和UDP-GlcDH之間相對強度的szHasA/szHasB mRNA比率高時，發(fā)酵液中HA的Mw相對較小，而當szHasA/szHasB mRNA比率減小時，Mw則變大。分析認為，合成HA能力與合成HA底物能力之間的相對強弱是影響微生物HA

10、Mr的重要因素之一，szHasA和szHasB mRNA拷貝數(shù)之間的比率高時，活細胞體內(nèi)每一個HAS分子能夠分配到的用來合成HA的底物就相對較少，則每一個HAS分子能夠合成的HA糖鏈就相對較短，從而造成合成的HA的Mw就較??；而當這一比率降低時，每一個HAS分子就有相對較多的底物分子可以用來合成HA糖鏈，從而造成合成的HA的糖鏈較長，Mw也變大。這一理論的確定，為通過調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)HAS的表達水平和底物濃度來控制微生物生產(chǎn)過程中發(fā)酵液中

11、HA Mr特性提供了切實可行的解決方案，具有重大的理論意義和潛在應(yīng)用價值。 本論文的主要內(nèi)容： （1）通過NICE系統(tǒng)，將獸疫鏈球菌HA合成代謝途徑相關(guān)基因?qū)肴樗崛榍蚓瑯?gòu)建一系列工程菌株。分析各工程菌株合成HA的濃度，證明利用代謝工程手段在乳酸乳球菌中引入編碼HAS的基因，可以該菌株獲得利用葡萄糖合成HA的能力。但自身合成的HA底物的不足限制HAS在工程菌株中合成高濃度的HA，而提高工程菌株HA底物的濃度，有助于HA合

12、成能力的提高。 （2）通過融合PCR方法得到一個重組HA合成操縱子，利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng)，將該重組HA合成操縱子導(dǎo)入乳酸乳球菌，實現(xiàn)在同一株工程菌株中重組表達異源szHasA，同時超表達同源UDP-GlcDH和LACR，表達這三個合成HA關(guān)鍵酶的乳酸乳球菌工程菌株具備了合成食品級HA的能力。 （3）構(gòu)建了一個雙質(zhì)粒的調(diào)控表達系統(tǒng)，包括表達szllasA的載體pN28148-szHasA和表達s

13、zllasB的載體pN29531-szHasB中。在工程菌株NFHA04中實現(xiàn)了不同誘導(dǎo)條件下改變szHasA與szHasB之間表達水平比率的實驗?zāi)康摹?（4）不同誘導(dǎo)條件下，分析szHasA/szHasB mRNA比率對乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量（Mw）的影響。證明合成HA能力與合成HA底物能力之間的相對強弱是影響微生物HA Mr的重要因素之一，szHasA和szHasB mRNA拷貝數(shù)之間的比率高時，活

14、細胞體內(nèi)每一個HAS分子能夠分配到的用來合成HA的底物就相對較少，則每一個HAS分子能夠合成的HA糖鏈就相對較短，從而造成合成的HA的Mw就較?。欢斶@一比率降低時，每一個HAS分子就有相對較多的底物分子可以用來合成HA糖鏈，從而造成合成的HA的糖鏈較長，Mv也變大。 本論文主要創(chuàng)新點： （1）首次通過融合PCR方法得到重組HA合成操縱子。并首次在同一乳酸乳球菌工程菌株中實現(xiàn)了重組表達異源szHasA，同時超表達同源UDP

15、-GlcDH和LACR。 （2）首次利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng)，在乳酸乳球菌終建立了透明質(zhì)酸合成途徑。該乳酸乳球菌工程菌株具備合成食品級HA的能力。 （3）首次在乳酸乳球菌工程菌株中實現(xiàn)了獸疫鏈球菌HAS與UDPGlcDH的同時誘導(dǎo)可控表達。 （4）首次在活體微生物體內(nèi)證明HA合成能力與底物合成能力之間的相對強弱具有調(diào)控HA Mw的作用。這一理論的確定，為通過調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)HAS的表達水平和底