高分子量透明質(zhì)酸發(fā)酵工藝的研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是由葡萄糖醛酸與N-乙酰氨基葡萄糖組成的雙糖單位重復(fù)連接而成的微生物多糖，作為一種生物高分子聚合物，透明質(zhì)酸由于其自身的優(yōu)良特性，在醫(yī)藥、化妝品、食品保健等領(lǐng)域得到廣泛研究與應(yīng)用。分子量顯著影響透明質(zhì)酸理化特性與應(yīng)用效果。高分子量HA(Mr＞2×106Da)一般應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，而低分子量HA(Mr＜1×106Da)一般應(yīng)用于化妝品和食品領(lǐng)域。通常，分子量越高，價(jià)格越高。
　　微生物發(fā)

2、酵法是目前透明質(zhì)酸的主要生產(chǎn)方法，本研究以Streptococcuszooepidemicus為發(fā)酵菌株，通過考察營養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件以及細(xì)胞膜通透性對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響，篩選出透明質(zhì)酸分子量的顯著影響因素，并將其進(jìn)行優(yōu)化組合，最終獲得高產(chǎn)量和高分子量統(tǒng)一的發(fā)酵工藝。本論文主要研究內(nèi)容如下:
　　第一，基于透明質(zhì)酸代謝途徑的特性，先后考察了碳源、氮源、多聚磷酸鹽、丙酮酸鈉對(duì)透明質(zhì)酸分子量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用分批培養(yǎng)的方式同時(shí)保持較

3、高水平的葡萄糖(70g/L)供給，可以有效緩解菌體生長與透明質(zhì)酸合成對(duì)于共用資源-葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)，有利于高分子量透明質(zhì)酸的合成，透明質(zhì)酸分子量最高可達(dá)1.63MDa;提高有機(jī)氮源酵母粉的濃度(起始水平10g/L)以及流加氨水均不利于高分子量透明質(zhì)酸的合成;向透明質(zhì)酸發(fā)酵體系中添加較高聚合度的多聚磷酸鹽((NaPO3)6)可以弱化菌體生長與透明質(zhì)酸合成的能量競(jìng)爭(zhēng)，當(dāng)(NaPO3)6添加量為3g/L，分子量最高可達(dá)2.27MDa;較高濃度的丙

4、酮酸鈉可以顯著減弱糖酵解與透明質(zhì)酸合成途徑對(duì)共用資源的競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)高分子透明質(zhì)酸的合成，當(dāng)其添加量為8g/L時(shí)，分子量最高可達(dá)2.14MDa，將上述營養(yǎng)強(qiáng)化策略組合應(yīng)用于透明質(zhì)酸的發(fā)酵，最終產(chǎn)量和分子量分別達(dá)到5.58g/L和2.35MDa，比優(yōu)化前各自提高了20％和44.2％。
　　第二，從pH、溫度、通氣和攪拌速率四個(gè)方面考察了培養(yǎng)條件對(duì)于透明質(zhì)酸分子量的影響。pH和溫度顯著影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量，當(dāng)pH=7時(shí)，透明質(zhì)酸產(chǎn)量最

5、高，達(dá)到4.71g/L，當(dāng)pH=8時(shí)，透明質(zhì)酸分子量最大，達(dá)到2.28 MDa，;當(dāng)溫度在37℃條件下時(shí)，透明質(zhì)酸產(chǎn)量最高，當(dāng)溫度在31℃時(shí)，透明質(zhì)酸分子量最大，達(dá)到2.34MDa;通氣和攪拌速率顯著影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量，當(dāng)攪拌速率為600rpm，通氣速率為1vvm時(shí)，透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量同時(shí)達(dá)到最高值?；诖?，提出溫度和pH兩階段調(diào)控發(fā)酵策略，顯著提升了透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量。將該策略和營養(yǎng)強(qiáng)化策略結(jié)合，最終產(chǎn)量和分子量分別達(dá)到了

6、5.65g/L和2.5 MDa。
　　第三，考察表面活性物質(zhì)和磷脂類物質(zhì)對(duì)透明質(zhì)酸分子量影響。先后比較了陽離子型表面活性劑CPC、陰離子型表面活性劑SDS、非離子表面活性劑吐溫-60以及磷脂酰膽堿對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加磷脂酰膽堿可以顯著改善透明質(zhì)酸的結(jié)果，在發(fā)酵的第8小時(shí)添加150mg/L的磷脂酰膽堿可以使透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量達(dá)到最高的2.54MDa。最后將磷脂酰膽堿添加與營養(yǎng)強(qiáng)化和兩階段調(diào)控培養(yǎng)策略結(jié)合應(yīng)用于透明質(zhì)酸