透明質(zhì)酸影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及對(duì)CD44-膜連接蛋白Ezrin、Merlin表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：⑴分離培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，建立原代人血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為后續(xù)研究提供目的細(xì)胞。⑵探討用不同分子量HA誘導(dǎo)HUVEC后細(xì)胞的增殖能力變化和細(xì)胞連接蛋白Ezrin、Merlin的表達(dá)狀況。⑶建立原代HUVEC的RNA干擾(RNAi)技術(shù)，干擾目的基因Ezrin和Merlin的mRNA表達(dá)。⑷探討HUVEC Ezrin和Merlin基因沉默后，HA誘導(dǎo)細(xì)胞中Ezrin和Merlin表達(dá)與HA分子量的相關(guān)性。

2、 方法：①分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：取本院剖腹產(chǎn)新生嬰兒臍帶(約15-25cm)，生理鹽水灌注沖洗靜脈腔后，加入I型膠原酶消化分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮專用培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)傳代。②免疫熒光檢測(cè)HUVEC細(xì)胞中Ezrin和Merlin的表達(dá)及分布。③分別合成三對(duì)針對(duì)Ezrin和Merlin基因的小干擾RNA，電穿孔法將各三對(duì)Ezrin和Merlin的siRNA導(dǎo)入HUVEC，接種于六孔板，EGM-2培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，篩選最適合干擾的一對(duì)

3、siRNA片段。④用選定Ezrin siRNA片段干擾HUVEC，RT-PCR與Western-blot證明干擾效率。 結(jié)果：⑴原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)10-15左右天長(zhǎng)成單層，細(xì)胞呈多角形，鋪路石樣排列。⑵免疫熒光證實(shí)HUVEC高表達(dá)Ezrin和Merlin。2.200μ g/ml nHA抑制HUVEC增殖，而10μg/mloHA促進(jìn)HUVEC增殖。3.200μ g/ml nHA誘導(dǎo)HUVEC后Ezrin和Merlin mRNA表達(dá)沒

4、有顯著差異，10μ g/ml oHA誘導(dǎo)HUVEC后EzrinmRNA水平在24h顯著升高，Merlin mRNA及蛋白表達(dá)與對(duì)照相比無顯著性差異。⑶電穿孔法成功干擾原代HUVEC，細(xì)胞存活率達(dá)70—80％以上。建立電擊干擾原代HUVEC細(xì)胞模型；siRNA干擾后Ezrin和Merlin基因的mRNA的表達(dá)水平分別降低達(dá)80-90％，干擾效率較好。⑷RT-PCR與Western-blot證明Ezrin siRNA干擾HUVEC成功，符合

5、實(shí)驗(yàn)要求；oHA誘導(dǎo)siEzrin HUVEC細(xì)胞增殖能力未發(fā)生顯著性改變，nHA誘導(dǎo)siEzrin HUVEC細(xì)胞增殖能力降低。 結(jié)論：①通過酶灌注法消化臍靜脈血管獲得細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便、高效，EGM-2培養(yǎng)基可保證內(nèi)皮細(xì)胞具有較高純度，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞生物學(xué)鑒定證明獲得人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。②不同分子量HA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有不同的增殖效應(yīng)，高分子量HA抑制細(xì)胞增殖，低分子量HA促進(jìn)細(xì)胞增殖；低分子量HA片段具有較為明確的促增

6、殖效應(yīng)，且與蛋白Ezrin表達(dá)具有相關(guān)性，而高分子量HA抑制增殖效應(yīng)與Merlin的相關(guān)性尚未明確。③siRNA成功干擾人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ezrin和Merlin的表達(dá)，電穿孔法干擾原代培養(yǎng)細(xì)胞具有較好干擾效果，操作簡(jiǎn)便，干擾效率高；干擾后Ezrin和Merlin基因的基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低。④通過阻斷Ezrin分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在Ezrin在失活或低表達(dá)狀態(tài)Merlin蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，由失活變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，發(fā)揮抑制細(xì)