靜脈表型分子COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞衰老的作用及機制.pdf

1、動脈粥樣硬化是造成心腦血管疾病和外周血管病的重要原因，是現(xiàn)代社會致死，致殘，嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量的主要因素之一。動脈粥樣硬化好發(fā)于動脈，靜脈與動脈同處于一個血管系統(tǒng)中，然而靜脈卻未見粥樣硬化。雖然與血流動力學等因素有關(guān)，但靜脈和動脈本身分子表型就不同，目前尚不清楚動靜脈對粥樣硬化易感性的差異，除受血流動力學等環(huán)境因素影響外，是否還與血管本身分子表型有關(guān)。
　　目的：
　　本研究旨在觀察特異表達于靜脈內(nèi)皮的COUP-TF

2、Ⅱ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞衰老和增殖的影響及可能的信號和分子機制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)，采用PCR方法檢測COUP-TFⅡ基因在離體HUVEC和HCAEC的表達水平的差異。
　　2.通過轉(zhuǎn)染COUP-TFⅡ-siRNA使HUVEC的COUP-TFⅡ表達降低，觀察COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞衰老增殖的影響。AngⅡ(10-5 mol/L)誘導48小時后，利用β

3、-半乳糖苷酶(β-gal)細胞染色，熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)和Western blot檢測衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達情況，觀察COUP-TFⅡ?qū)UVEC衰老的影響。利用CCK-8和細胞計數(shù)法檢測HUVEC的增殖情況。
　　3.為了進一步探究Akt信號對COUP-TFⅡ調(diào)控血管內(nèi)皮細胞衰老的影響，利用Western blot檢測了Akt/p-Akt的蛋白表達變化情況;加入Akt激動劑SC79后，用β-ga

4、l細胞染色和熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS的方法檢測HUVEC的衰老率、Western blot檢測衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達變化情況;用CCK-8法、細胞計數(shù)法檢測HUVEC增殖的變化情況，觀察Akt信號與COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞衰老和增殖影響的可能機制。
　　4.為了進一步探究胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)對COUP-TFⅡ調(diào)控血管內(nèi)皮細胞衰老的影響，利用Western blot檢測了IGFBP-

5、1的蛋白表達變化情況;加入IGFBP-1蛋白后，用β-gal細胞染色和熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS的方法檢測HUVEC的衰老率、Western blot檢測衰老相關(guān)基因P53的蛋白表達變化情況;用CCK-8法、細胞計數(shù)法檢測HUVEC增殖的變化情況，觀察IGFBP-1分子與COUP-TFⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細胞衰老和增殖影響的可能機制。
　　5.利用microRNA(miRNA)芯片技術(shù)探究COUP-TFⅡ?qū)iRNA表達譜的調(diào)

6、控影響。在無AngⅡ誘導下，分別提取3個Control組和si-COUP-TFⅡ組細胞樣本的RNA后，由華大基因公司進行miRNA OneArray(@)芯片檢測及分析。
　　結(jié)果：
　　1.與Control組相比，通過COUP-TFⅡ小干擾RNA轉(zhuǎn)染降低HUVEC細胞COUP-TFⅡ表達后，能夠顯著促進AngⅡ誘導的內(nèi)皮細胞衰老:我們分別檢測了內(nèi)皮細胞β-gal細胞染色的陽性細胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽性細胞率

7、和Western blot的P53蛋白表達。在AngⅡ為0 mol/L時，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組β-gal染色陽性率（0.0622±0.0192vs0.0665±0.0132;P＞0.05）、ROS陽性細胞率(0.0931±0.0111vs0.1120±0.0125; P＞0.05)、P53蛋白表達（1.0000±0.0544vs0.9870±0.0794;P＞0.05）均無顯著差異;在AngⅡ為10-5m

8、ol/L時，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組β-gal染色陽性率增高(0.4390±0.0673 vs0.8107±0.0452;P＜0.05)、ROS陽性細胞率增高(0.1536±0.0145 vs0.3306±0.0532; P＜0.05)、P53蛋白表達增高(1.0000±0.0956 vs1.4142±0.0633; P＜0.05)。
　　2.與Control組相比，通過COUP-TFⅡ小干擾RNA轉(zhuǎn)染

9、降低HUVEC細胞COUP-TFⅡ表達后，能夠顯著抑制AngⅡ誘導的內(nèi)皮細胞增殖:我們分別檢測了內(nèi)皮細胞在450nm的相對OD值和細胞計數(shù)值。在AngⅡ為0 mol/L時，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組的相對OD值(1.0000±0.0272vs0.9839±0.0315; P＞0.05)、細胞計數(shù)值((1.0417±0.0892)×105 vs(1.0938±0.0970)×105, P＞0.05）均無顯著差異;

10、在AngⅡ為10-5mol/L時，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，si-COUP-TFⅡ組的相對OD值降低（1.0000±0.0808 vs0.5743±0.0567; P＜0.05）、細胞計數(shù)值降低（（3.5188±0.0963）×105vs(2.0875±0.0973)×105; P＜0.05)。
　　3.Akt激動劑SC79(4ug/ml)能夠部分逆轉(zhuǎn)COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞衰老增殖的影響:我們分別檢測了內(nèi)皮細胞β-gal細

11、胞染色的陽性細胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽性細胞率和Western blot的P53蛋白表達。在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入Akt激動劑SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79組的β-gal染色陽性率降低(0.4436±0.0488 vs0.7558±0.0667 vs0.5154±0.0213; P＜0.05)、 ROS陽性細胞率降低(0.1325±0.0221 vs0.3404±0.0383 vs

12、0.2133±0.0205, P＜0.05)、 P53蛋白表達降低(1.0000±0.0665 vs1.4985±0.0710 vs1.0818±0.0603;P＜0.05);檢測內(nèi)皮細胞在450nm的相對OD值和細胞計數(shù)值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入Akt激動劑SC79后，si-COUP-TFⅡ+SC79組的相對OD值增高(1.0000±0.0613 vs0.5940±0.0296vs0.8250±0.038

13、5; P＜0.05)、細胞計數(shù)值增高（（4.3667±0.0933）×105 vs(1.6417±0.0969×105 vs(2.6958±0.0966)×105, P＜0.05)。
　　4.IGFBP-1(100ng/ml)蛋白能夠部分逆轉(zhuǎn)COUP-TFⅡ調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞衰老增殖的影響:我們分別檢測了內(nèi)皮細胞β-gal細胞染色的陽性細胞率、熒光探針DCFH-DA的ROS陽性細胞率和Western blot的P53蛋白表達。在AngⅡ

14、(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1組的β-gal染色陽性率降低(0.2121±0.0412 vs0.6423±0.0286 vs0.2616±0.0318; P＜0.05)、 ROS陽性細胞率降低(0.1382±0.0110 vs0.3357±0.0242 vs0.2620±0.0379,P＜0.05)、 P53蛋白表達降低(1.0000±0.1018 vs1.4626

15、±0.0459 vs1.1167±0.0481; P＜0.05);檢測內(nèi)皮細胞在450nm的相對OD值和細胞計數(shù)值，在AngⅡ(10-5mol/L)刺激作用下，發(fā)現(xiàn)加入IGFBP-1蛋白后，si-COUP-TFⅡ+IGFBP-1組的相對OD值增高(1.0000±0.0717 vs0.6051±0.0626vs0.9058±0.0607; P＜0.05)、細胞計數(shù)值增高((4.4667±0.0707)×105 vs(2.1583±0.09

16、05)×105vs(3.6271±0.0898)×105, P＜0.05)。
　　5.抑制內(nèi)皮細胞COUP-TFⅡ的表達后，共有27個miRNAs發(fā)生了顯著的差異表達，其中表達上調(diào)的有21個miRNAs，而表達下調(diào)的有6個miRNAs。在這些差異變化的miRNAs中，miR-642a-3p與脂質(zhì)代謝有關(guān);miR-513a-5p、miR-130a-3p、miR-221-3p和miR-652與炎癥反應(yīng)有關(guān);而miR-196a、miR-

17、1247、miR-92b和miR-363-5p與細胞增殖有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.抑制靜脈內(nèi)皮表型分子COUP-TFⅡ表達時，能促進AngⅡ誘導的靜脈內(nèi)皮細胞衰老、抑制其增殖，提示COUP-TFⅡ?qū)?nèi)皮細胞衰老具有保護作用，其分子機制可能與其調(diào)節(jié)Akt信號和IGFBP-1分子的表達有關(guān)。
　　2.抑制COUP-TFⅡ表達能改變靜脈內(nèi)皮miRNAs的表達譜，主要涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、細胞增殖等方面，提示COUP-TFⅡ可