雌激素對血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用及抗血管內(nèi)皮衰老機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景： 人口老齡化是廿一世紀(jì)人類發(fā)展的主要特征，在我國尤其明顯。根據(jù)新公布的國家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報(bào)告表明，二十世紀(jì)末，中國60歲以上老年人口占總?cè)丝诘谋壤^10％；2005年底，中國60歲以上老年人口近1.44億，占總?cè)丝诘谋壤_(dá)11％；當(dāng)前，中國老年人口正以年均約3％的速度增長，并將以每10年純增1億老年人口的速度加速老齡化進(jìn)程。隨著老年人口的增多，我國老年人疾病譜也由相對分散向集中轉(zhuǎn)變，發(fā)病率前五位是高血壓、冠心病、腦

2、血管病、糖尿病、腫瘤。其中以動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為表現(xiàn)的心腦血管病在老年人群中的高發(fā)病率、高致死率、高致殘率使其成為威脅老年人健康的首要疾病。因此急需開展AS發(fā)病機(jī)制及防治對策的研究。 AS發(fā)生的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素包括高血壓、高血脂、吸煙、高血糖、年齡以及性別等，以往一直認(rèn)為年齡屬于AS不可改變的危險(xiǎn)因素，因而研究相對較少。隨著人口老齡化的日益發(fā)展，有關(guān)年齡在AS發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究逐漸引起重視，并成為防

3、治AS的新靶點(diǎn)。流行病學(xué)研究表明年齡是AS發(fā)生與發(fā)展的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，隨著年齡的增加，促使AS的發(fā)生率顯著升高的一個(gè)最具有老年人群特點(diǎn)的原因是血管隨增齡發(fā)生了變化，部分血管細(xì)胞發(fā)生了衰老。在老齡人的血管，血管的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的改變、血管管腔擴(kuò)大而彈性降低、血管壁的細(xì)胞發(fā)生功能障礙，血管壁基質(zhì)成分也發(fā)生顯著的變化。這些獨(dú)立于動(dòng)脈粥樣硬化之外而發(fā)生的衰老變化改交了各種心腦血管疾病的病理生理機(jī)制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴(yán)重程度和預(yù)后?，F(xiàn)在越

4、來越多的研究發(fā)現(xiàn)AS血管中的細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，細(xì)胞的衰老可能是AS形成的重要原因已逐漸被廣泛認(rèn)同?，F(xiàn)在不少老年醫(yī)學(xué)的專家甚至建議將抗衰老治療當(dāng)作治療AS的一項(xiàng)新的治療策略。那么隨著增齡血管為什么會(huì)發(fā)生這些變化，血管細(xì)胞為什么會(huì)衰老，隱藏在血管這些變化后的細(xì)胞和分子水平的病理學(xué)機(jī)制是什么?這種機(jī)制是否可為改善或者延緩AS提供重要思路?在人口老齡化日益發(fā)展的現(xiàn)狀下，這已成為AS防治亟需回答的關(guān)鍵問題之一。 對于血管增齡性變化機(jī)制的研

5、究首先涉及的是衰老機(jī)制問題。目前有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說有數(shù)十多種，總體來說最終歸結(jié)為兩大類型：一類是以活性氧簇(Reactiveoxygenspecies，ROS)、糖基化、線粒體受損等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論，另一類是以端?？s短、衰老基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論，這兩大類理論從不同角度闡述了機(jī)體衰老的可能機(jī)制，使衰老的研究不斷向細(xì)胞、分子和基因水平深入。在眾多的衰老學(xué)說中，自由基一線粒體損傷學(xué)說最被廣泛認(rèn)同。

6、該學(xué)說的主旨指發(fā)生在線粒體內(nèi)的惡性循環(huán)促進(jìn)了衰老的的發(fā)生。該惡性循環(huán)的大體內(nèi)容是(1)線粒體電子傳遞鏈在正常的能量代謝過程中，產(chǎn)生氧自由基；(2)這些產(chǎn)生的氧自由基，對線粒體內(nèi)的磷脂、蛋白質(zhì)、核酸造成氧化損傷；(3)氧自由基對mtDNA的損傷導(dǎo)致mtDNA的突變，從而使線粒體呼吸鏈復(fù)合物的各亞基合成減少，活性下降，功能下降的呼吸鏈復(fù)合物在能量合成的過程將會(huì)產(chǎn)生更多的氧自由基副產(chǎn)物；(4)這種惡性循環(huán)將導(dǎo)致更多的mtDNA突變，從而致使衰

7、老以及與衰老相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生。 雌激素(E2)是天然的血管保護(hù)劑。女性較男性有更低的心血管疾病、腦中風(fēng)發(fā)生率，并且女性比男性更長壽，雌激素被認(rèn)為在其中起重要作用，而絕經(jīng)后女性的心血管疾病發(fā)生率明顯上升，進(jìn)一步證明了這一個(gè)論點(diǎn)。所以雌激素的血管保護(hù)作用及其作用機(jī)制一直受到廣泛的研究，盡管有許多致力于雌激素的心血管保護(hù)作用及抗衰老作用機(jī)制的研究，但其作用機(jī)制還被完全闡明，近年來，隨著線粒體內(nèi)雌激素受體的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸將對雌激素

8、的心血管保護(hù)作用機(jī)制及抗衰老研究焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到其與線粒體之間作用關(guān)系上來。 雌激素的各種生理效應(yīng)是通過其受體ERα和ERβ實(shí)現(xiàn)的。ER分布于許多組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿生殖道、胃腸道、骨組織、腎臟、肺臟和子宮。近年來人們在臍靜脈和冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞上檢測到雌激素受體，為其在心血管的保護(hù)作用提供了論理基礎(chǔ)。雌激素通過細(xì)胞內(nèi)不同部位的ER產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。首先，雌激素通過胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，與胞質(zhì)ER結(jié)合，形成激素

9、.受體復(fù)合物，最后與DNA片段雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。第二，雌激素可通過細(xì)胞膜結(jié)合受體發(fā)揮迅速的非基因組效應(yīng)。第三，近年來研究發(fā)現(xiàn)，隨著線粒體上受體的發(fā)現(xiàn)，線粒體被認(rèn)為是雌激素作用的重要靶標(biāo)，雌激素有可能是通過核受體和線粒體里的受體協(xié)調(diào)呼吸鏈復(fù)體物蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮其心血管保護(hù)作用及抗衰老作用。 目的： 因此本文利用活性氧刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生誘導(dǎo)型細(xì)胞衰老模型，并觀察雌激素對內(nèi)皮細(xì)胞衰老的干預(yù)作用，同

10、時(shí)觀察線粒體各項(xiàng)功能指標(biāo)(細(xì)胞色素C氧化酶活性，ATP水平)及線粒體結(jié)構(gòu)，并測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，以證實(shí)雌激素的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用及證實(shí)該作用是通過保護(hù)線粒體功能實(shí)現(xiàn)的。另外，為了進(jìn)一步證實(shí)其作用是通過ER來實(shí)現(xiàn)，我們還用雌激素的特異性受體阻滯劑ICI182780對雌激素的作用進(jìn)行干預(yù)，觀察ICI182780能否阻斷雌激素的以上保護(hù)作用。 方法： 1.購買人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行傳代，采用3-6代細(xì)胞使用60μmol/

11、L過氧化氫(H2O2)作用內(nèi)皮細(xì)胞72h產(chǎn)生誘導(dǎo)型細(xì)胞衰老模型。 2.將細(xì)胞分成四組(1)A組：不含任何刺激；(2)B組：用含60μmol/LH2O2的完全培養(yǎng)液作用細(xì)胞72h；(3)C組：在B組基礎(chǔ)上，在H2O2刺激前1h先用0.1μmol/L17β-雌二醇刺激；(4)D組：在C組基礎(chǔ)上，在17β-雌二醇刺激前30min先用10μmol/L的ICI182780刺激。細(xì)胞染色法檢測各組細(xì)胞的β-半乳糖苷酶表達(dá)情況。 3.

12、采取上述分組，每組5例，使用β-半乳糖苷酶染色，在普通光鏡下數(shù)各組細(xì)胞染色陽性率。 4.采取上述分組，每組5例，收集細(xì)胞，分離線粒體并用BCA法測定線粒體內(nèi)蛋白濃度。 5.將上述各分組的中獲得的線粒體樣品進(jìn)行線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性的測定。 6.采取上述分組，每組5例，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ATP水平的測定。 7.采取上述分組，每組7例細(xì)胞完成刺激后用DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平8采取上述分組，收

13、集細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)標(biāo)本處理在電鏡下觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)。統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。 結(jié)果： 1.各組SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase)染色陽性率比較四組細(xì)胞染色陽性率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(采用單向方差分析檢驗(yàn)，F(xiàn)=308.372P=0.000

14、)，其中。與空白組相比，H2O2刺激組陽性細(xì)胞率增多具有顯著性意義(P<0.01)；而17β-雌二醇能干預(yù)H2O2的作用(P<0.01)；而ICI18278即可阻斷17β-雌二醇的保護(hù)作用(P<0.01)。 2.各組線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性比較單項(xiàng)方差分析顯示各組線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性存在顯著差異(F=70.065，P=0.000)。其中，與空白組相比，H2O2能使細(xì)胞色素C氧化酶活性下降(P<0.01)；而該下降作用能被

15、17β-雌二醇干預(yù)(P<0.01)；而ICI182780即可阻斷17β-雌二醇的保護(hù)作用(P<0.01)。 3.各組細(xì)胞內(nèi)ATP水平的比較單項(xiàng)方差分析顯示各組線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性存在顯著差異(F=7.605，P=0.002)。其中，與正常對照組相比，H2O2刺激組的細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降(P<0.01)；但同樣能被17β-雌二醇干預(yù)(P<0.01)；而17β-雌二醇的保護(hù)作用也被ICI182780阻斷(P<0.05)。

16、 4.各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的比較各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平存在顯著差異(采用單向方差分析檢驗(yàn)，F(xiàn)=16.345，P=0.000)。其中，與空白組相比，H2O2刺激組的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著上升(P<0.01)；而17β-雌二醇能干預(yù)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的上升(P<0.01)；而17β-雌二醇+ICI182780組可使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平再度下降(P<0.01)。 5.各組細(xì)胞線粒體形態(tài)比較與空白組比較，H2O2刺激組使細(xì)胞線粒體受損，表現(xiàn)為線

17、粒體數(shù)目少，線粒體肥大，畸形較多，嵴腫脹；而17β-雌二醇組上述變化明顯減輕，線粒體形態(tài)與空白組基本一致；ICI182780組的細(xì)胞內(nèi)線粒體變化與H2O2刺激組基本一致。 結(jié)論： 1.60μmol/LH2O2作用72h能夠誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生提前衰老。 2.E2能夠抑制活性氧誘導(dǎo)的早衰HUVEC的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。 3.E2能夠保護(hù)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ的活性。 4.E2能夠使線粒體的能量合成增加