利用質(zhì)譜技術(shù)篩選RIP3激酶下游底物.pdf

1、RIP3作為受體相互作用蛋白家族（Receptor interacting-protein RIPs）重要的一員，是具有特異的絲氨酸(Serine)/蘇氨酸（Threonine）激酶活性的蛋白。研究表明，RIP3是TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死相互轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)，RIP3是TNF誘導(dǎo)多種細(xì)胞（如L929細(xì)胞、N細(xì)胞、MEF細(xì)胞）的壞死所必需的。因此，RIP3在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面有著重要的作用。雖然RIP3在調(diào)控細(xì)胞壞死發(fā)揮著重要作用，但其

2、作為一個(gè)磷酸激酶，對(duì)其下游調(diào)控的底物卻知之甚少。哪些蛋白會(huì)被RIP3及其下游激酶磷酸化，在介導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中RIP3與哪些蛋白相互作用，RIP3介導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制等科學(xué)問題亟待解決。
　　 因此本論文試圖使用定量磷酸化組的方法去尋找RIP3激酶的底物，在研究中，本論文以來源于RIP3野生型小鼠和RIP3敲除小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞和永生化的小鼠胚胎纖維原細(xì)胞為研究對(duì)象，分別用TNF和LPS刺激細(xì)胞，然后比較RIP3野生型成纖維

3、細(xì)胞和RIP3敲除型成纖維細(xì)胞及野生型巨噬細(xì)胞和RIP3敲除型巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白組的差異。文章利用一系列技術(shù)，如SILAC（穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)）及其spike-in SILAC技術(shù)、FASP（超濾管輔助樣品制備）、IMAC（金屬離子偶聯(lián)親和層析）、HILIC（親水相互作用親和層析）以及納升液相串聯(lián)質(zhì)譜，深入地分析了RIP3野生型細(xì)胞和RIP3敲除型細(xì)胞之間磷酸化蛋白組的不同，而且本論文證實(shí)這種方法確實(shí)可行，所得數(shù)據(jù)也具有可

4、信性。本研究鑒定到巨噬細(xì)胞中4306個(gè)蛋白的14057個(gè)磷酸化肽段和MEF細(xì)胞中1785個(gè)蛋白的4732個(gè)磷酸化肽段，其中在巨噬細(xì)胞和MEF細(xì)胞中總共篩選到14081個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這些磷酸化位點(diǎn)中有6131個(gè)已知的磷酸化位點(diǎn)，而其中另外7950個(gè)磷酸化位點(diǎn)到目前為止還未被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)研究中又利用生物信息學(xué)分析揭示了RIP3激酶及其下游激酶可能的底物識(shí)別基序，其中pSXP motif很可能是RIP3特異識(shí)別的基序。本論文的研究工作篩選到了一