TNF-α-RIP3在金黃色葡萄球菌感染損傷機(jī)制中的作用及地塞米松干預(yù).pdf

1、本文主要從以下幾個部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 TNF-α/RIP3在金黃色葡萄球菌感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　1.研究TNF-α對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，以下簡稱金葡菌）感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制;
　　2.探討受體結(jié)合蛋白3(receptor-interacting protein，RIP3)在金葡菌感染A

2、549細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法：
　　A549細(xì)胞傳代后接種于96孔板、6孔板或培養(yǎng)瓶，含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至約90％皿底面積時，金葡菌感染細(xì)胞以建立細(xì)胞感染模型，細(xì)菌感染前24h改用無雙抗RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
　　1.金葡菌感染對細(xì)胞活力的影響
　　金葡菌以不同感染分?jǐn)?shù)（multiplicity of infection，MOI）分別為(0、1、5

3、、25、50、100)感染A549細(xì)胞，于感染6h終止，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放試驗檢測細(xì)胞活力;金葡菌(MOI25)感染A549細(xì)胞，分別于感染2h、6h、12h、24h終止，LDH釋放試驗檢測細(xì)胞活力。
　　2.TNF-α對A549細(xì)胞活力的影響
　　不同濃度TNF-α（0、10、50、100ng/ml）處理細(xì)胞6h，LDH釋放試驗檢測細(xì)胞活力。
　　3.透射電鏡觀察金葡

4、菌和TNF-α引起的A549細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)變化
　　金葡菌(MOI25)和TNF-α（50ng/ml）處理A549細(xì)胞，設(shè)對照組、SA組（金葡菌感染組）、TNF-α組和SA+TNF-α組（金葡菌感染同時加TNF-α處理細(xì)胞），各組細(xì)胞予相應(yīng)處理12h，采用透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)變化。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)和western blot檢測TNF-α和金葡菌對A549細(xì)胞的損傷作用
　　金葡菌(MOI25)感染A549細(xì)胞

5、，實(shí)驗設(shè)對照組、SA組（金葡菌感染組）、TNF-α組（50ng/ml TNF-α處理細(xì)胞）、TNF-α+抗TNF-α抗體組（TNF-α聯(lián)合抗TNF-α抗體500ng/ml中和TNF-α處理細(xì)胞）、SA+TNF-α組（金葡菌感染同時加TNF-α處理細(xì)胞）和SA+TNF-α+抗TNF-α抗體組（金葡菌感染加TNF-α聯(lián)合抗TNF-α抗體處理細(xì)胞）。各組細(xì)胞予相應(yīng)處理12h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡/壞死情況，western blot檢測細(xì)胞R

6、IP3、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1, cleaved caspase-1)和cleavedcaspase-8蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.金葡菌以MOI和感染時間依賴性方式影響A549細(xì)胞活力
　　MOI增加，細(xì)胞活力降低。感染6h，金葡菌(MOI25)組A549細(xì)胞細(xì)胞死亡率較對照組相比顯著升高(P＜0.0

7、1)。隨金葡菌感染時間延長，A549細(xì)胞活力降低。金葡菌(MOI25)，感染6h，細(xì)胞死亡率較對照組顯著升高(P＜0.05)。
　　2.TNF-α對A549細(xì)胞活力的影響
　　TNF-α處理A549細(xì)胞6h，與對照組相比，TNF-α（100 ng/ml）組細(xì)胞死亡率顯著升高(P＜0.01)，而TNF-α(10、50 ng/ml)組均無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.金葡菌和TNF-α引起A549細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)改變<

8、br>　　金葡菌(MOI25)和/或TNF-α（50ng/ml）處理A549細(xì)胞12h，透射電鏡觀察到SA組和TNF-α組部分細(xì)胞呈凋亡表現(xiàn);SA+TNF-α組部分細(xì)胞呈晚期凋亡、壞死狀態(tài)。
　　結(jié)論：
　　1.金葡菌感染A549細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.RIP3依賴的程序性壞死參與金葡菌感染A549細(xì)胞誘發(fā)的細(xì)胞損傷。
　　3.TNF-α增強(qiáng)金葡菌對A549細(xì)胞的損傷作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活RIP3

9、依賴的程序性壞死有關(guān)。
　　第二部分 地塞米松佐治小鼠金黃色葡萄球菌肺部感染及RIP3表達(dá)研究
　　目的：
　　1.探討地塞米松佐治小鼠金葡菌肺部感染的作用及機(jī)制;
　　2.觀察RIP3在小鼠金葡菌肺部感染中的表達(dá)。
　　方法：
　　1.地塞米松佐治小鼠金葡菌肺部感染模型建立及分組
　　小鼠用1.5％濃度的戊巴比妥鈉(0.1ml/20g)腹腔注射麻醉，經(jīng)27號針氣管插管，肺部感染模型組滴入50μ

10、l金葡菌菌液（約5.0×108 CFU）。隨機(jī)分為金葡菌感染組（SA組），金葡菌感染+苯唑西林組（OX組），金葡菌感染+苯唑西林+低劑量地塞米松組[OX+DEX(1)組]，金葡菌感染+苯唑西林+中劑量地塞米松組[OX+DEX(2.5)組]，金葡菌感染+苯唑西林+高劑量地塞米松組[OX+DEX(5)組]。各分48h和120h亞組。金葡菌肺部感染及干預(yù)組（分別為15只/48h亞組和10只/120h亞組）。對照組（PBS組）氣管滴入50μl無

11、菌磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate bufferred saline，PBS）。PBS組及SA組:腹腔注射生理鹽水(normalsodium，NS);OX組:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次。OX+DEX(1)組:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，聯(lián)合地塞米松(1mg/kg/d)，每天1次;OX+DEX(2.5)組:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，聯(lián)合地塞米松(2.5m

12、g/kg/d)，每天1次;OX+DEX(5)組:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，聯(lián)合地塞米松(5mg/kg/d)，每天1次。造模30min后予注射苯唑西林，再過2h予注射地塞米松。
　　2.小鼠肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)標(biāo)本留取
　　水合氯醛麻醉法處死存活小鼠，逐層開胸，分離肺組織，絲線結(jié)扎左主支氣管，再切開氣管，用20號針頭行氣管插管，絲線固定，

13、經(jīng)氣管行右肺灌洗，用1ml無菌PBS分2次于氣管插管處注入，緩慢沖洗右肺3次，可回收約0.8ml。
　　3.肺組織細(xì)菌載量
　　在無菌條件下，將未經(jīng)灌洗的小鼠右肺組織置于研磨器中，加入2ml無菌PBS緩沖液研磨至無肉眼可見的組織塊。將勻漿液連續(xù)倍比稀釋并接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)平板，37℃培養(yǎng)24h，計數(shù)平板菌落數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.肺組織細(xì)菌載量
　　氣管滴入

14、造模48h，OX+DEX(1)組、OX+DEX(2.5)組較OX組肺勻漿細(xì)菌載量無顯著差異，而OX+DEX(5)組細(xì)菌清除率降低。
　　2.肺組織HE染色及MPO陽性細(xì)胞浸潤
　　氣管滴入造模48h，肺組織HE染色可見肺泡腔、細(xì)支氣管腔大量炎性細(xì)胞浸潤及蛋白水腫液滲出、肺泡結(jié)構(gòu)破壞;OX+DEX(2.5)組和OX+DEX(5)組半定量病理學(xué)評分較OX組顯著降低;造模120h，OX+DEX(2.5)和OX+DEX(5)組半定量

15、病理學(xué)評分較OX組低。造模48h，免疫組化示SA組和OX組小鼠的肺泡及肺間質(zhì)有大量MPO陽性細(xì)胞浸潤，而OX+DEX(2.5)和OX+DEX(5)組小鼠肺組織中僅有少量MPO陽性細(xì)胞浸潤。
　　3.BALF中總蛋白含量和sRAGE水平
　　造模48h，SA組小鼠BALF中的總蛋白顯著升高，而OX+DEX(2.5)組較OX組低;SA組小鼠BALF中sRAGE(210.1±26.8ng/ml)較PBS組(4.5±0.2ng/ml

16、)約升高46倍，而OX+DEX(2.5)組和OX+DEX(5)組BALF中sRAGE濃度分別為135.7±28.2(ng/ml)和140.8±21.3(ng/ml)，較OX組(181.6±16.1ng/ml)低。
　　4.BALF中白細(xì)胞數(shù)，中性粒細(xì)胞數(shù)，TNF-α、KC、IL-6、IL-10蛋白水平及其肺組織mRNA表達(dá)
　　造模48h，OX組小鼠的BLAF白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞較SA組無顯著性差異;而OX+DEX(2.5)組

17、和OX+DEX(5)組BLAF白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)均較OX組低。OX+DEX(2.5)組和OX+DEX(5)組BALF中的TNF-α、KC和IL-6蛋白水平較OX組降低。同時，OX+DEX(2.5)組和OX+DEX(5)組肺組織中的TNF-α、KC和IL-6的mRNA水平較OX組顯著下調(diào)。
　　5.金葡菌肺部感染小鼠肺組織RIP3、caspase-8、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)情況
　　造模48h，SA組小鼠