牛源性重組金黃色葡萄球菌β-溶血素亞單位疫苗對金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺內(nèi)感染小鼠的保護研究.pdf

1、本試驗通過采用金葡菌Newbould305建立了小鼠泌乳期乳腺內(nèi)感染的乳腺炎動物模型，并在此基礎(chǔ)上探討牛源性重組金葡菌β-溶血素(β-hemolysin，β-HL)亞單位疫苗對小鼠乳腺局部、整體的防御體系及炎癥相關(guān)因子的影響，為乳腺炎的生物防治提供新思路。
　　 1.牛源性金葡菌攻擊下小鼠泌乳期感染模型的建立
　　 選擇48只未孕雌鼠隨機分為6組(n=8)，產(chǎn)后7-10d分別在小鼠的第四對乳腺內(nèi)灌注經(jīng)過毒力活化的細(xì)菌懸液

2、5.0×102CFU/50μL(E1)、1.0×103CFU/50μL(E2)、5.0×103CFU/50μ.L(E3)、1.0×104CFU/50μL(E4)和1.0×105CFU/50μL(E5)，對照組小鼠乳腺內(nèi)注入同劑量的無菌的PBS，48h處死。觀察小鼠乳腺組織中細(xì)菌數(shù)量、TNF-α、IL-2和IL-6含量的變化及乳腺組織形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明實驗組乳腺組織中分離到細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，E3達到最高。組織形態(tài)學(xué)上對照組腺

3、泡結(jié)構(gòu)完整，E1組和E2組腺泡內(nèi)主要以漿液性滲出為主，E3組腺泡壁增厚，腺泡腔內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞(PMN)增多，隨著劑量的增大E4和E5組腺泡壁破裂，甚至個別樣品出現(xiàn)壞死灶。與對照組相比，E3組小鼠乳腺組織中TNF-α、IL-2和IL-6含量極顯著升高(P＜0.01)，整體來看呈先升高后下降的趨勢。由結(jié)果可知5.0×103CFU/50μL(E3)劑量下的金葡菌攻擊下的小鼠乳腺炎性反應(yīng)與炎癥的免疫病理過程一致，故選擇此劑量作為小鼠乳腺內(nèi)感染的

4、病理模型的造模劑量。
　　 2.重組金葡菌β-溶血素亞單位疫苗對小鼠金葡菌性乳腺炎的保護效果研究
　　 48只雌鼠隨機分成對照組、造模組、pET-32a(+)質(zhì)粒蛋白免疫不攻毒組、pET-32a(+)質(zhì)粒蛋白免疫攻毒組、β-HL免疫不攻毒組、β-HL免疫攻毒組(n=8)，用Ni-NTAAgarose純化目的蛋白，Bradfrod法對目的蛋白進行蛋白含量測定，無菌將蛋白制作成疫苗免疫小鼠。產(chǎn)后7-10天分別在小鼠的第四對乳

5、腺內(nèi)灌注經(jīng)過毒力活化的細(xì)菌懸液5.0×103CFU/50μL，用ELISA方法測定抗體效價，并分離攻毒后小鼠乳腺中細(xì)菌、觀察乳腺勻漿中細(xì)胞因子的含量變化及通過瓊脂糖免疫雙向擴散試驗觀察pET-32a(+)載體對金葡菌重組β-溶血素的影響。結(jié)果表明純化的β-HL和pET-32a(+)質(zhì)粒蛋白分別在57kD和20.5kD處顯示單一條帶，蛋白含量分別為950μg/ml和1.45mg/ml；β-HL重組蛋白和pET-32a(+)質(zhì)粒蛋白免疫小鼠

6、都能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，隨著免疫次數(shù)的增加，產(chǎn)生的相應(yīng)抗體滴度也逐漸增加；pET-32a(+)免疫攻毒組和β-HL免疫攻毒組乳腺勻漿中的TNF-α和IL-2的含量與空白攻毒組相比有所變化，但差異不顯著(P＞0.05)，之間不存在統(tǒng)計學(xué)意義，但與各自相應(yīng)對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)意義。而pET-32a(+)免疫攻毒組乳腺勻漿中的IL-6含量與空白攻毒組之間，二者存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而β-HL免疫攻毒組則變化不大；通過瓊脂糖免疫雙向擴散試