牛源金黃色葡萄球菌單鏈抗體的制備及保護(hù)作用研究.pdf

1、奶牛乳腺炎不僅影響奶牛業(yè)的發(fā)展，也給乳品生產(chǎn)帶來了巨大的損失。引起奶牛乳腺炎的病原菌很多，其中金黃色葡萄球菌是最重要的致病菌。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎一方面主要采用抗生素治療，但此治療方法導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)的越來越多，而且抗性奶對人類的健康也帶來了一定的威脅。另一方面主要采用疫苗，但目前針對金黃色葡萄球菌活的或者滅活的菌體，分離的黏附素、毒素和多糖等毒力因子制作的疫苗對防治奶牛乳腺炎效果都不理想。因?yàn)橐呙绲闹饕饔脵C(jī)理是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)

2、生抗體，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)針對金黃色葡萄球菌的新型抗體制劑受到了研究者的青睞。單鏈抗體(single-chain variable region fragment，scFv)是由抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過柔性短肽連接構(gòu)成，且保留了較完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)。scFv作為基因工程抗體的一種有著不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：分子量小，穿透組織的能力強(qiáng)，不包含F(xiàn)c片段，可以避免非特異性的結(jié)合。此外，已有越來越多的scFv

3、藥物應(yīng)用到一些疾病的臨床治療中?；诖?，本研究構(gòu)建了針對金黃色葡萄球菌的牛源scFv并對其功能和保護(hù)作用進(jìn)行研究，旨為奶牛乳腺炎抗體制劑的研發(fā)提供一定的依據(jù)。
　　1牛源抗金黃色葡萄球菌 FnbpA和 ClfA單鏈抗體的構(gòu)建
　　設(shè)計(jì)擴(kuò)增?？贵wVH和VL引物對于準(zhǔn)確擴(kuò)增牛源scFv編碼基因至關(guān)重要！但目前關(guān)于牛源的scFv鮮有報(bào)道，本文通過分析數(shù)據(jù)庫中有關(guān)牛抗體基因相關(guān)線索，篩選并設(shè)計(jì)了一對引物，從患金黃色葡萄球菌乳腺炎的奶

4、牛外周血淋巴細(xì)胞中提取RNA作為模板擴(kuò)增scFv的VH和VL，利用重疊延伸PCR將VH和VL通過linker-(Gly4Ser)3連接構(gòu)建scFv；然后將scFv基因克隆入原核表達(dá)載體pOPE101-XP后轉(zhuǎn)化E.coli XL1-Blue進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并提取周質(zhì)腔可溶性蛋白；最后通過間接ELISA的方法篩選針對金黃色葡萄球菌感染過程中重要的毒力因子纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnbpA)和凝集因子(ClfA)的牛源scFv。最終我們獲得了兩株親和

5、力較高的陽性克隆scFvZW.28和scFvZW.132，Western blot分析表明兩株scFv能夠與FnbpA和ClfA特異性結(jié)合，且在體外LB培養(yǎng)基上能一定程度抑制金黃色葡萄球菌的生長。本章研究一方面驗(yàn)證確定了編碼牛源scFv基因的有效引物，為后面牛源scFv噬菌體文庫的構(gòu)建提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；另一方面也證明了研制牛源scFv用于抑制金黃色葡萄球菌是可行的，為后續(xù)牛源scFv的研制及功能研究提供了有力的支撐。
　　2牛源單鏈

6、抗體噬菌體表達(dá)文庫的構(gòu)建和抗金黃色葡萄球菌單鏈抗體的篩選
　　通過前面驗(yàn)證確定的擴(kuò)增編碼牛源scFv基因的引物構(gòu)建了牛源scFv噬菌體表達(dá)文庫。首先從患金黃色葡萄球菌乳腺炎的奶牛外周血淋巴細(xì)胞中提取 RNA作為模板擴(kuò)增VH和VL，采用重疊延伸PCR將VH和VL通過linker-(Gly4Ser)3連接構(gòu)建 scFv基因并與噬菌粒載體 pCANTAB-5E連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化 TG1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過50次電轉(zhuǎn)后得到了庫容量為2×10

7、6cfu/mL的噬菌體文庫，且文庫的陽性率高，多樣性良好。以金黃色葡萄球菌全菌裂解產(chǎn)物作為抗原對噬菌體文庫經(jīng)過四輪的反復(fù)淘選后，文庫滴度為107cfu/mL，富集了81倍。從第四輪中隨機(jī)挑取96個(gè)克隆制備噬菌體抗體，采用噬菌體ELISA的方法，篩選到了8株針對金黃色葡萄球菌全菌抗原的親和力較高的scFv(OD450>0.6)，命名為scFvZW.1，ZW.2，ZW.12，ZW.22，ZW.33，ZW.68，ZW.73和ZW.88。這8株

8、scFv的基因序列FR區(qū)比較保守，CDR區(qū)變異較大，尤其是VH的CDR3區(qū)。
　　3針對金黃色葡萄球菌的牛源單鏈抗體的原核表達(dá)及其保護(hù)作用研究
　　上一節(jié)中通過噬菌體展示技術(shù)篩選到了針對金黃色葡萄球菌全菌抗原的8個(gè)scFv，但由于噬菌粒載體pCANTAB-5E為E-tag標(biāo)簽載體，目前還沒有較好的純化E-tag的方法，所以本章中我們將8個(gè)scFv基因片段裝入pET-28a(+)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并純化。純化的8個(gè)scFv和它們

9、的混合物在LB培養(yǎng)基內(nèi)與金黃色葡萄球菌共同孵育進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)的研究，抑菌結(jié)果顯示8個(gè)抗體體外能不同程度抑制金黃色葡萄球菌的生長，其中scFvZW.12，ZW.88，8個(gè)scFv混合物抑菌作用較好。在動物的保護(hù)試驗(yàn)中，針對不同抗原表位抗體的“雞尾酒”組合能產(chǎn)生累加和協(xié)同效應(yīng)，比單一抗體作用更強(qiáng)，所以我們采用8個(gè)scFv聯(lián)合作用來研究其對金黃色葡萄球菌所致小鼠乳腺炎的保護(hù)作用。24只泌乳10-15d的昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組(C)、陰性

10、處理組(NC)、陽性處理組(PC)和scFv治療組(scFv)。正常對照組和陰性處理組小鼠第四對乳腺攻入生理鹽水，陽性處理組和scFv治療組第四對乳腺分別攻入青霉素和8個(gè)scFv混合物。6h后，除正常對照組小鼠第四對乳腺各攻入50μL生理鹽水外，其余三組攻入50μL108cfu/mL的金黃色葡萄球菌。結(jié)果顯示，相對于生理鹽水的陰性處理組，scFv治療組乳腺組織細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的含量顯著升高(P<0.05)，炎癥因子TNF-α

11、的含量顯著降低(P<0.05)。同時(shí)病理切片顯示，scFv治療組乳腺結(jié)構(gòu)相對完整，炎性細(xì)胞滲出較少。說明scFv對金黃色葡萄球菌所致小鼠乳腺炎有一定的保護(hù)作用。這些為防治奶牛乳腺炎的抗體制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　4牛源金黃色葡萄球菌單鏈抗體基因治療小鼠乳腺炎的研究
　　與完整的抗體相比，scFv分子量小，組織的穿透力強(qiáng)，免疫原性低，作為藥物的靶向載體有很多優(yōu)勢，但是它半衰期短，在血漿中的清除速度快，作為藥物的治療制劑還存在

12、著一定的缺陷；而真核DNA質(zhì)粒在組織中不僅能表達(dá)目的蛋白，且可以存在兩個(gè)月之久。所以本章將前面篩選到的針對金黃色葡萄球菌全菌抗原的scFvZW12和scFvZW88插入到真核載體pcDNA3.1中構(gòu)建重組質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體的方法將兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。Western blot分析結(jié)果表明，pcDNA3.1-scFv12和pcDNA3.1-scFv88不僅可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也能分泌到培養(yǎng)液上清中進(jìn)行分泌型表達(dá)。將 pcDNA3.1

13、-scFv12和 pcDNA3.1-scFv88的混合質(zhì)粒經(jīng)第四對乳腺導(dǎo)管注入到泌乳7d的小鼠的乳腺中，結(jié)果顯示，scFvs蛋白3d的時(shí)候開始表達(dá)，7d時(shí)表達(dá)量開始上升。30只泌乳7d的昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組(C)、陰性處理組(NC)、陽性處理組(PC)、scFv-Low治療組(SL)和scFv-High治療組(SH)。C和NC組小鼠經(jīng)第四對乳腺導(dǎo)管攻入pcDNA3.1空白質(zhì)粒100μg，SL和 SH組小鼠經(jīng)第四對乳腺導(dǎo)管分別攻入

14、pcDNA3.1-scFv12和pcDNA3.1-scFv88的混合質(zhì)粒100μg和200μg。7d后，PC組小鼠第四對乳腺攻入青霉素。6h后，除正常對照組小鼠第四對乳腺各攻入50μL生理鹽水外，其余四組攻入50μL108cfu/mL的金黃色葡萄球菌。結(jié)果顯示，相對于生理鹽水的陰性處理組，SH治療組乳腺組織炎癥因子IL-1β的含量顯著降低，TNF-α和IL-6有降低的趨勢。病理切片顯示，SH治療組乳腺結(jié)構(gòu)相對完整，炎性細(xì)胞滲出較少。說明