耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌mrsa

1、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌M R S AMethicillin Resistant Staphylococcus Aureus,范 紅 黨華偉 四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床微生物試驗室,,,Case 1,反復(fù)咳嗽，咳痰10余年，再發(fā)伴胸悶、大汗淋漓40天;因“慢支、肺氣腫并雙下肺感染＋急性左心衰” 入院治療;血RT : WBC : 9.0X10 9/L N : 0.80 L : 0.15;痰細(xì)/真菌培養(yǎng)：金黃色葡萄球菌

2、（+），大腸桿菌（+），肺炎克雷 伯菌（+）,鮑曼/溶血不動桿菌（+）;白色念珠菌（+）;入院前已使用了阿莫西林－克拉維甲酸，引發(fā)黑便，新喹諾酮類和四 代頭孢菌素，總療程約40天。用氟康唑片6天。,,入院,左氧氟沙星0.2 ivdrip qd 7天，后改加替沙星 0.2mg ivdrip qd 9天，未見肺部炎癥好轉(zhuǎn)， 加用阿齊霉素 0.5 ivdrip

3、qd 7天后肺部羅音有所好轉(zhuǎn)，比原來明顯減少，但是仍然在雙下肺后部可以聽到羅音，同時患者出現(xiàn)腹瀉;查大便RT＋OB，未見偽膜，OB（－），未見WBC,未見RBC，真菌＋/－;痰細(xì)/真菌培養(yǎng): 金黃色葡萄球菌（+）;大便細(xì)/真菌培養(yǎng): 金黃色葡萄球菌（+）；先后使用阿貝卡星、頭孢唑啉 、泰能等不同種類抗生素；痰細(xì)/真菌培養(yǎng): 金黃色葡萄球菌（+）;大便細(xì)/真菌培養(yǎng): 金黃色葡萄球菌（+）；病人出現(xiàn)菌血癥、高燒、終因呼吸衰竭死亡。

4、,http://www.365heart.com/bbs_lead/Announce/announce.asp?BoardID=73&ID,四川大學(xué)華西醫(yī)院2006年第一季度臨床常見病原菌耐藥分析 實驗醫(yī)學(xué)科微生物實驗室  我院實驗醫(yī)學(xué)科臨床微生物實驗室2006年第一季度常見病原菌按檢出菌株數(shù)排列，前8位分別是大腸埃希菌（281株）、金黃色葡萄球菌（231株）、綠膿假單孢菌（170株）、鮑曼/溶血

5、不動桿菌（175菌）、肺炎克雷伯菌 （108株）、表皮葡萄球菌（77株）、陰溝腸桿菌（64株）、嗜麥芽窄食黃單孢菌（73株）。 超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）：大腸埃希菌122/281（43.42） 肺炎克雷伯菌 41/108(37.96%) 產(chǎn)酸克雷伯菌 3/19 (15.80%)

6、 耐甲氧西林的金黃色葡萄球 （MRSA）199/231（86.15%） 耐甲氧西林的表皮葡萄球菌 （MRSE）63/77 （81.82%）,表II 常見革蘭陽性球菌的耐藥情況,【注：分母為檢出菌株數(shù)，分子為耐藥株數(shù)，%為耐

7、藥率。】,常見革蘭陽性球菌的耐藥情況 （四川大學(xué)華西醫(yī)院2006年第一季度）,主要內(nèi)容,一，MRSA,,生物學(xué)特性耐藥機(jī)理分型及檢測流行狀況治療和預(yù)防,二，CA-MRSA/HA-MRSA,三，討論,,流行病學(xué)致病性耐藥機(jī)制抗生素選擇,青霉素（1940s） 金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控制 產(chǎn)青霉素酶，能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，表現(xiàn)為對青霉素的耐藥 耐青霉素酶的半合成

8、青霉素，即甲氧西林(methicillin) 時隔兩年，英國的Jevons就首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistanStaphylococcusaureus,MRSA),MRSA,,,,,一、MRSA： 生物學(xué)特性：(1),營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37°C，最適生長pH

9、 7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。(2),血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長。可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。(3),甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。,,,表面光滑、凸起、濕潤 , 直徑 1 ～ 2mm ?；液谏梁谏?, 有光澤 , 常有淺色 ( 非白色 ) 的邊緣

10、, 周圍繞以不透明圈 ( 沉淀 ), 其外常有一清晰帶 ( 卵磷脂環(huán) ) 。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感。,BP瓊脂上典型特征,,Baird-Parker,,典型的金葡為球型，直0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜,金黃色葡萄球菌在甘露醇鹽平板上的菌落,,,,,,,,,掃 描 電 鏡,,,引起深部感染的主要致病菌之一，包括肺部感染，腦、肺、肝、腎、乳腺等臟器膿腫，骨髓炎，膿毒性關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)

11、膜炎，敗血癥，膿毒病(sepsis)等,,肺膿腫病理學(xué)切片,由金黃色葡萄球菌引起的敗血癥病人血培養(yǎng)的革蘭染色,MRSA的分型,MRSA分型對追蹤傳染源，研究型別與感染種類，耐藥性的關(guān)系有重要作用;噬菌體分型、質(zhì)粒圖譜分型、免疫印跡法、血清學(xué)、凝固酶、耐藥譜方法分型。現(xiàn)在Southern印跡法也逐漸運(yùn)用于MRSA的分型。,MRSA的生物學(xué)特性,不均一耐藥性 敏感亞群：30%-60%

12、 耐藥亞群：40%-70% 廣譜耐藥性　 對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹 喏酮類、磺胺類、利福平等均產(chǎn)生不同程度的耐藥， 唯對萬古霉素敏感。,MRSA的耐藥機(jī)理,固有耐藥,獲得性耐藥　 獲得性耐藥 是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥。某些菌株通過耐藥因子產(chǎn)生大

13、量β-內(nèi)酰胺酶， 使耐酶青霉素緩慢失活，表現(xiàn)出耐藥性，多為臨界耐藥。,,耐β-內(nèi)酰胺類,,,固有耐藥,,,,,,,,,,,,編碼抑制因子,編碼誘導(dǎo)因子,吸引其他耐藥基因,多重耐藥基因存放點(diǎn),染色體盒重組基因復(fù)合體,插入子,葡萄球菌染色體mec基因盒SCCmec,,對其他各類抗生素的耐藥機(jī)制,MRSA還可通過改變抗生素作用靶位，產(chǎn)生修飾酶，降低膜通透性產(chǎn)生大量PABA等不同機(jī)制，對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹喏酮類、磺胺類、

14、利福平均產(chǎn)生不同程度的耐藥,MRSA的檢測,MRSA的檢出率受孵育溫度、時間、培養(yǎng)基的pH和NaCl的濃度、菌液的數(shù)量等多種 因素的影響。且由于MRSA的不均一耐藥性，給其檢測帶來一定的困難。,MRSA的檢測,1　紙片擴(kuò)散法(K-B法)　MH瓊脂厚度為4 mm，菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋籽跷髁趾? μg/片，35°C孵育24 h，抑菌圈≤11 mm為耐藥，≥17 mm為敏感;苯唑西林(1 μg/片)在貯存過程中藥效不

15、易降低，且對不均一耐藥性檢測效果更好， 抑菌圈≤10 mm為耐藥，≥13 mm為敏感，11～12 mm為中介。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213(耐藥菌株)，金黃色葡萄球菌ATCC 25923(敏感菌株);優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便、價格便宜;,紙片擴(kuò)散法(K-B法),MRSA的檢測,2　肉湯稀釋(MIC)法　MH肉湯培養(yǎng)基加NaCl至20 g/L濃度，同時加入Ca,Mg離子，將苯唑西林進(jìn)行倍比稀釋，從0.125～16 μg/ml

16、，菌濃度為104/ml，35°C孵育24 h;MIC＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥，該法檢出率可達(dá)95%;操作較繁瑣;,MRSA的檢測,3　瓊脂稀釋(MIC)法　用含20 g/L NaCl的MH瓊脂將苯唑西林倍比稀釋為12個不同濃度并澆注平皿;苯唑西林量終濃度為0.125～256 μg/ml;菌液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?點(diǎn)種于含藥平皿，35°C孵育24 h;適用于大量菌株的MRSA檢測，結(jié)果容易

17、判斷，重復(fù)性好，但耗時，費(fèi)力;,MRSA的檢測,4　瓊脂篩選法　MH培養(yǎng)基加NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 μg/ml)，將菌液(0.5麥?zhǔn)蠞岫?點(diǎn)種或畫線35°C孵育24 h，只要平皿有菌生長，即使一個菌落也是MRSA，敏感度為100%，常用作校正其它方法的標(biāo)準(zhǔn)，尤其適用于檢測抑菌圈直徑處于中介度的金黃色葡萄球菌。,MRSA的檢測,5　濃度梯度(Etest)法　在含20 g/L NaCl的MH瓊脂平板上，貼

18、上苯唑西林的試條，菌液調(diào)至0.5～1麥?zhǔn)蠞岫?5°C孵育24 h，直接讀取MIC值;MIC＜2 μg/ml為敏感，＞4 μg/ml為耐藥。長塑料條含有連續(xù)的呈指數(shù)梯度變化的苯唑西林(0.016～256μg/ml)，故在檢測低水平或中等程度耐藥的MRSA時結(jié)果更為準(zhǔn)確;精確、可靠、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，但缺點(diǎn)是價格昂貴;,MRSA的檢測,6　自動化藥敏檢測　目前有Vitek系統(tǒng)、ATB系統(tǒng)、MicroScan系統(tǒng)、Sensite

19、r ARIS等;將菌液稀釋后注入藥敏板或孔內(nèi)，然后通過檢測菌液濁度，熒光指示劑的熒光強(qiáng)度或熒光底物的水解反應(yīng)來判讀結(jié)果;其優(yōu)點(diǎn)是快速，但有時對生長緩慢或延遲表達(dá)耐藥性的MRSA，在3～4 h內(nèi)難以達(dá)到檢測水平，容易漏檢或誤報MRSA;,MRSA的檢測,7　DNA探針雜交　上述的方法都是檢測MRSA耐藥表型的方法;對于低水平耐藥或臨界水平耐藥的MRSA，應(yīng)選擇特異性高的分子生物學(xué)方法來檢測;DNA探針雜交是用特異性的mec A

20、DNA片段經(jīng)地高辛標(biāo)記，與可疑菌株進(jìn)行雜交;其特異性高于瓊脂稀釋法，敏感性高于肉湯稀釋法，而且可直接用于臨床標(biāo)本，無需先進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，但探針較貴，保存期較短;,MRSA的檢測,8　PCR技術(shù)　根據(jù)金黃色葡萄球菌TK 784的mec A基因DNA序列設(shè)計一引物，再裂解提取被測菌的DNA，在一定條件下進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳后在紫外燈下觀察有無與陽性對照菌株(金黃色葡萄球菌ATCC29213)相同的區(qū)帶。PCR具有較高的靈敏度，因此常

21、作為檢測MRSA的參考方法。,,MRSA的治療和預(yù)防,MRSA的治療　萬古霉素是三環(huán)糖肽類抗生素，其具有抑制細(xì)胞壁合成，破壞細(xì)胞膜及阻礙細(xì)菌RNA合成的多種作用，是目前臨床上治療MRSA唯一療效肯定的抗生素；1996年日本報道第一例對萬古霉素中度敏感(MIC=8μg/ml)的金黃色葡萄球菌；NCCLS規(guī)定：萬古霉素敏感≤4 μg/ml，中介8～16 μg/ml，耐藥≥32 μg/ml；除萬古霉素外，還有壁霉素、香豆霉素等新藥對M

22、RSA有較 強(qiáng)的抗菌活性。另外，萬古霉素也可與磷霉素、利福平、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物合用，加強(qiáng)治療效果。,MRSA的治療和預(yù)防,MRSA預(yù)防　 首先是合理使用抗生素； 早期檢出帶菌者； 加強(qiáng)消毒制度；,MRSA感染的流行概況,美國 NNIS報道1975年182所醫(yī)院MRSA占金黃色葡萄球菌感染總數(shù)的2.4%

23、 1991年上升至24.8%，其中尤以500張床以上的教學(xué)醫(yī)院和中心醫(yī)院為多；歐洲 1993年1417家醫(yī)院ICU分離的MRSA達(dá)60%；日本 Kansai醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MRSA的分離率1993年達(dá)到41%；上海 1978年在200株金黃色葡萄球菌中MRSA只占5%，1988年上升至24% 1996年激增至72%；天津 1988年調(diào)查MRSA分離率為47%；北京 醫(yī)科

24、大學(xué)附屬醫(yī)院1996年分離MRSA達(dá)58.3%；山東淮坊 1996年在三家醫(yī)院的嬰兒室分離出金黃色葡萄球菌198株，其中 MRSA為112株(56.5%) ；武漢 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附院1992年分離MRSA就達(dá)79.6%；,,二，CA-MRSA/HA-MRSA,CA-MRSA：Community Acquired MRSA 社區(qū)獲得性

25、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌HA-MRSA: Hospital Acquired MRSA 醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,,流行病學(xué)致病性耐藥機(jī)制抗生素選擇,CA-MRSA/HA-MRSA,流行病學(xué),1, 國外學(xué)者 國內(nèi)學(xué)者,,CA-MRSA所占比例逐年增高；,2，年齡構(gòu)成：中外學(xué)者報道類似，即CA-MRSA患 者

26、平均年齡小于HA-MRSA患者，以中青年為主， 且多無基礎(chǔ)性疾病。,致病性,1，產(chǎn)生的外毒素不同2，基因水平的研究,,殺白細(xì)胞毒素致病力更強(qiáng),超抗原腸毒素B和腸毒素C,,PVL基因,葡萄球菌腸毒素基因： seb、sec、she基因等,耐藥機(jī)制,1，,,CA-MRSA：I、II、III HA-MRSA ：IV、 V,2， CA-MRSA增多的原因,,HA-MRSA出院患者直接將感染的

27、MRSA傳給,社區(qū)人群社區(qū)MSSA 患者獲得了IV、 V 型mec基因,抗生素選擇,1， HA-MRSA：目前以糖肽類為主，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（Vancomycin Resistant Staphylococcus Aureus VRSA ）;2，CA-MRSA：環(huán)丙沙星、克林霉素等；3，對萬古霉素敏感但療效不明顯，疑與異質(zhì)性有關(guān)；,討 論,多重耐藥的鮑曼不動桿菌在近些年也出現(xiàn)了嚴(yán)重的院內(nèi)流行；MSSA