三黃茵赤湯通過抑制RIP3介導(dǎo)的程序性壞死防治急性肝衰竭.pdf

1、目的：
　　觀察三黃茵赤湯對急性肝衰竭大鼠生化指標(biāo)及程序性壞死相關(guān)蛋白的影響，探討急性肝衰竭過程中是否發(fā)生程序性壞死。通過人源性肝細(xì)胞LO2進(jìn)一步探討急性肝衰竭發(fā)生程序性壞死的分子機(jī)制，尋找防治急性肝衰竭的分子靶點(diǎn)，為臨床上使用三黃茵赤湯提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　取48只SD大鼠，隨機(jī)分為六組：正常組、模型組、三黃茵赤湯高、中、低劑量組、雙黃醇組，每組8只(n=8)，先予以連續(xù)灌藥給藥5天后，除正常組外，余各組腹

2、腔注射10μg/kg LPS，30min后注射700mg/kg的D-GalN，復(fù)制急性肝衰竭模型。2天后注射戊巴比妥鈉麻醉(400mg/kg)，取肝組織及血清。HE染色觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理變化，免疫印跡法檢測RIP3蛋白表達(dá)。取LO2細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱里，用含10％FBS和1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。MTT法檢測不同濃度D-GalN對LO2細(xì)胞生存率的影響，并篩選出最佳濃度。通過以上實(shí)驗(yàn)測得的最佳D-G

3、alN濃度及作用時(shí)間進(jìn)行分組：正常對照組、D-GalN模型組、Nec-1組(Nec-160mmol/L預(yù)處理1h后再加入D-GalN)及三黃茵赤湯高、中、低劑量組(三黃茵赤湯高、中、低劑量預(yù)處理24小時(shí)后再加入D-GalN)。采用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、壞死率及細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Hoechst/PI染色觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫印跡法(WB)檢測RIP1及RIP3蛋白表達(dá)，熒光定量PCR(qPCR)

4、檢測RIP1/RIP3mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　與急性肝衰竭大鼠模型組比較，三黃茵赤湯高、中、低劑量組、雙環(huán)醇組均能減少血清中ALT、AST、TBIL，改善肝組織病理變化，下調(diào)RIP3的表達(dá)(P＜0.05)，其中高劑量及雙環(huán)醇組效果最佳。在體外實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，三黃茵赤湯高、中、低劑量組均能提高細(xì)胞生存率和ROS的清除率，降低Hoechst、PI染色熒光強(qiáng)度，降低細(xì)胞晚期凋亡率、壞死率(P＜0.05)，下調(diào)RIP

5、1、RIP3、Caspase-3及RIP1/RIP3mRNA的表達(dá)(P＜0.05);其中三黃茵赤湯中劑量組降低細(xì)胞晚期凋亡率、壞死率，提高細(xì)胞生存率的效果最好(P＜0.05)，與Nec-1抑制劑組效果相當(dāng)。
　　結(jié)論：
　　1.在D-GalN聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠中，可能發(fā)生了程序性壞死，且三黃茵赤湯可以改善急性肝衰竭大鼠肝臟功能，降低RIP3的表達(dá)，達(dá)到防治急性肝衰竭的作用。
　　2.三黃茵赤湯對D-GalN