血紅素加氧酶-1介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性肝衰竭的機制研究.pdf

1、目的：
　　急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是一種由多種因素導(dǎo)致的以快速和嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷為特征，伴隨著肝臟功能的缺失，導(dǎo)致了肝性腦病、凝血功能障礙、黃疸及進(jìn)行性的多器官功能衰竭的臨床綜合征。目前，內(nèi)科綜合治療效果較差;肝移植是治療肝衰竭最有效手段，但是供肝短缺、排斥反應(yīng)及長期使用免疫抑制劑伴隨的并發(fā)癥等，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。近年研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC

2、)移植治療急性肝衰竭取得了顯著的療效，它促進(jìn)了肝細(xì)胞的再生和肝功能的恢復(fù)，為急性肝衰竭的治療提供了新的方向。中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分;當(dāng)肝臟組織出現(xiàn)壞死和炎癥時，大量中性粒細(xì)胞向其趨化，通過分泌炎癥因子及氧化爆發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞的大量壞死。血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素代謝的限速酶，具有抗氧化、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)功能。有研究表明，MSC可以誘導(dǎo)體內(nèi)HO-1蛋白的表達(dá)，但MSC是否能通過誘導(dǎo)HO-1

3、進(jìn)而抑制中性粒細(xì)胞對肝臟的二次打擊尚不可知。本研究在建立D-氨基半乳糖聯(lián)合內(nèi)毒素所致ALF的大鼠模型，探討MSC是否通過誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)來抑制中性粒細(xì)胞的活性及其向肝臟的趨化來緩解ALF，為MSC移植治療ALF的機制提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分:
　　將72只SD大鼠隨機分為對照（Control）組:腹腔注射生理鹽水;急性肝衰竭(ALF)組:腹腔注射D-Gal0.8g·kg-1及LPS20μg·kg-1;

4、 MSC治療組:在誘導(dǎo)急性肝衰竭6h后MSC治療組給予1x106個/ml SD大鼠來源的骨髓MSC陰莖背靜脈注射。觀察第24h、48h、72h、120h和148h血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及膽紅素(T-bil)的變化趨勢及肝臟的病理變化。(1)自動生化儀檢測大鼠NH3、ALT及AST水平(n=14);(2)觀察各組大鼠生存率(n=10);(3)顯微鏡觀察大鼠肝臟蘇木紫-伊紅染色(n=14);(4)流式細(xì)胞儀用于鑒定間充

5、質(zhì)干細(xì)胞純度(CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)。
　　第二部分:將120只SD大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為5組，即對照組(control):腹腔注射生理鹽水、急性肝衰竭(ALF)組:腹腔注射D-Gal0.8g·kg-1及LPS20μg·kg-1制作急性肝衰竭模型;MSC治療(ALF+MSC)組;給予D-Gal及LPS(方法同急性肝衰竭組)，6h后大鼠陰莖背靜脈移植含106個骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的1ml PBS溶液;ALF

6、+MSC+鋅原臥啉（Znpp，HO-1拮抗劑）組:在MSC治療組的基礎(chǔ)上給予Znpp50μmol·kg-1腹腔注射;血晶素（Hemin，HO-1誘導(dǎo)劑）治療(ALF+Hemin)組:給予D-Gal及LPS，6h后腹腔注射Hemin40μmol·kg-1，每組24只。分別于誘導(dǎo)肝衰后1、3、5、7天斷尾取血，使用全自動生化儀檢測肝功能;取48h肝臟組織，免疫組化檢測中性粒細(xì)胞(MPO)、增殖(Ki67)、凋亡(Tunel)及血紅素加氧酶-

7、1(HO-1)表達(dá)情況;Western blot檢測肝臟HO-1及相關(guān)通路(p38、Erk、JNK及NF-κB)水平變化;流式細(xì)胞儀用于檢測外周血中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)(DHR123)情況;同時檢測肝臟MDA、MPO活性及HO-1活性變化;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠炎癥因子(IL1β、TNFα、IFNγ)水平變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:成功建立D-Gal聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的ALF模型，急性肝衰竭后血AST、ALT及T

8、-bil水平明顯升高;當(dāng)使用MSC靜脈移植治療后，大鼠血NH3、AST、T-bil及ALT水平出現(xiàn)明顯下降(p＜0.05)，大鼠肝臟蘇木紫-伊紅染色顯示MSC治療后肝臟損傷程度減輕;ALF組大鼠死亡率為80％，MSC治療組大鼠死亡率為下降為40％。
　　第二部分:Western blot及免疫組織化學(xué)染色顯示HO-1水平在ALF+MSC組、ALF+MSC+ Znpp組及ALF+Hemin組中都出現(xiàn)明顯升高(p＜0.05); HO-

9、1活性在ALF+MSC組和ALF+Hemin組中上升明顯，而在ALF+MSC+ Znpp組其活性出現(xiàn)下降(p＜0.05)。ALF組肝臟組織損傷嚴(yán)重，血NH3、AST及ALT水平升高(P＜0.05)，MPO、Tunel陽性的中性粒細(xì)胞數(shù)量增多，外周血中性粒細(xì)胞的氧化爆發(fā)能力(P＜0.05)、MDA及MPO活性都出現(xiàn)了升高(P＜0.05)，IL1β、TNFα、IFNγ升高(P＜0.05);在MSC移植或Hemin治療后肝臟病理損傷情況下降，

10、血NH3、AST及ALT水平下降(P＜0.05)，MPO及Tunel陽性細(xì)胞數(shù)量下降(P＜0.05)，同時Ki67陽性的細(xì)胞數(shù)量升高(P＜0.05);外周血中性粒細(xì)胞的氧化爆發(fā)能力下降(P＜0.05)、肝臟MDA及MPO活性都出現(xiàn)了下降(P＜0.05)，血清IL1β、TNFα、IFNγ下降。然而，Znpp使MSC的治療作用部分消除。Western結(jié)果顯示NF-κB通路參與了HO-1介導(dǎo)的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　(1)骨髓