清熱解毒涼血化瘀法聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭模型大鼠及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與鑒定
　　目的:使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其純度。
　　方法:
　　1.分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)，多次傳代的方法純化細(xì)胞:
　　(1)取3-5周齡SFP級(jí)SD大鼠，剪開腿部皮膚及肌肉組織，無菌環(huán)境下取出雙側(cè)股骨及脛骨，清理干凈附著組織，剪斷兩端，使用磷酸鹽緩沖液沖出骨髓，1200r

2、/min離心4min后棄上清液，加入以L-DMEM+10％胎牛血清配置的培養(yǎng)液吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞密度，種于直徑70mm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種細(xì)胞數(shù)約為1*106-7。
　　(2)上一步接種的細(xì)胞經(jīng)48h首次全量更換培養(yǎng)液，以后每48h或72h全量換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋皿底面積的70％-80％時(shí)，以0.25胰蛋白酶消化后1∶2傳代，傳至第4代備用。
　　2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)鑒定:
　　取

3、生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第4代細(xì)胞，胰酶消化，羊血清封閉，洗滌之后相應(yīng)抗體標(biāo)記，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性的CD29、CD44以及表達(dá)陰性的CD34、CD45。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離出貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)篩選后得到呈梭形或多角形生長(zhǎng)，有偽足，旋渦狀或火焰狀分布的細(xì)胞。
　　2.經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，CD29細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)99.2％、CD44細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)99.4％，CD34細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)4.5％，CD45細(xì)胞

4、陽(yáng)性率達(dá)16.9％，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。
　　結(jié)論:
　　采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，經(jīng)過多次傳代能夠從SD大鼠骨髓中分離篩選出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　第二部分：清熱解毒涼血化瘀法聯(lián)合BMSCs治療急性肝衰竭模型大鼠機(jī)制的初步研究
　　目的:采用清熱解毒涼血化瘀中藥灌胃聯(lián)合干細(xì)胞移植的方式治療急性肝衰竭模型大鼠，對(duì)比僅采用干細(xì)胞移植方法治療的效果，通過:
　　1.檢測(cè)血清肝功能、肝損傷相關(guān)細(xì)胞因子(TN

5、F-α、IL-10)等指標(biāo);
　　2.觀察肝組織病理切片以及熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝內(nèi)的定植情況;初步研究清熱涼血解毒化瘀中藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療肝衰竭的效果和機(jī)制。
　　方法:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記
　　將第一部分培養(yǎng)得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度后用熒光標(biāo)記劑CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞。
　　2.建立急性肝衰竭模型大鼠
　　取體重約為180g-220g清

6、潔級(jí)SD大鼠，腹腔注射1.4g/kg的D-galN，48h后將仍存活的大鼠隨機(jī)抽取5只采集血清及肝組織，檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)并與正常大鼠比較，驗(yàn)證造模成功與否。
　　3.急性肝衰竭大鼠的中藥+干細(xì)胞聯(lián)合治療
　　(1)將存活的急性肝衰竭模型大鼠隨機(jī)分為4組（A組:中藥聯(lián)合干細(xì)胞治療組;B組:干細(xì)胞治療組;C組:中藥治療組;D組:模型對(duì)照組;）分別做以下處理:
　?、貯、B兩組:以1％戊巴比妥鈉麻醉，腹部剃毛，消毒、鋪巾后

7、于中上腹部作1個(gè)約2cm長(zhǎng)的縱行切口，經(jīng)門靜脈輸入熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，每只大鼠輸入細(xì)胞數(shù)量約為1*106個(gè)，輸入完畢后逐層關(guān)腹，以無菌紗布覆蓋。
　?、贑、D兩組大鼠手術(shù)處理同前，找到i門靜脈后經(jīng)門靜脈輸入與A、B組大鼠等體積的用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液。
　　(2)手術(shù)后第1天起，A組大鼠以茵陳四苓顆粒灌胃，B組大鼠灌服等量蒸餾水，C組大鼠以茵陳四苓顆粒灌胃，D組大鼠灌服等量蒸餾水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食，飼普通塊料，飲5

8、％葡萄糖溶液。
　　4.檢驗(yàn)標(biāo)本的采集及檢測(cè)
　　于治療7天后所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后腹腔動(dòng)脈采血、采集肝組織，制作肝臟病理切片，觀察肝衰竭損傷恢復(fù)情況及干細(xì)胞定植生長(zhǎng)情況，檢測(cè)血清總膽紅素、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶、腫瘤壞死因子-a、白介素-10等指標(biāo);通過RT-PCR法檢測(cè)肝組織白蛋白、甲胎蛋白等指標(biāo)判斷各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝功能恢復(fù)程度。
　　結(jié)果:
　　1.腹腔注射D-氨基半乳糖48h后大鼠急性肝衰竭模型成功建立，60只實(shí)驗(yàn)大鼠在

9、24h內(nèi)死亡9只，48h內(nèi)共死亡13只，另抽取5只驗(yàn)證造模效果，剩余35只大鼠進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行手術(shù)后觀察7d，模型組大鼠（D組）活動(dòng)減少，食欲不振，飲水減少，毛發(fā)蓬亂，尿色深黃，體重減輕，約5d后開始逐漸恢復(fù);各治療組大鼠癥狀表現(xiàn)均較模型組大鼠輕，飲食及活動(dòng)恢復(fù)較早，約3d后開始逐漸恢復(fù)。
　　各組大鼠生存情況:
　?、貯組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡1只，2d內(nèi)共死亡2只;
　?、贐組大鼠手術(shù)后

10、1d內(nèi)死亡1只，2d內(nèi)共死亡2只;
　?、跜組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡2只，2d內(nèi)共死亡2只;
　?、蹹組大鼠手術(shù)后1d內(nèi)死亡2只，2d內(nèi)共死亡3只，3d內(nèi)共死亡4只;
　　其余各組大鼠均存活超過7天;
　　3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　?、俨扇≈委煷胧┑?組（A、B、C組）大鼠TNF-α水平低于模型對(duì)照組（D組），IL-10水平高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　?、诟髦委熃M間比較，A組

11、與B、C兩組比較，TNF-α水平較其他兩組低，IL-10水平較其他兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但B組與C組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
　?、俑鱾€(gè)治療組ALT、TBIL指標(biāo)相比模型組均有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　?、诟鱾€(gè)治療組之間的肝功能指標(biāo)比較:A組ALT、TBil指標(biāo)相比 B組和C組有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B組上述指標(biāo)相對(duì)C組有改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.肝臟

12、病理切片
　?、貯組經(jīng)過BMSCs+中藥聯(lián)合治療后，炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)，靜脈周圍膽管增生;
　　②B組炎癥浸潤(rùn)亦顯著減少，但匯管區(qū)仍有炎癥浸潤(rùn)，肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù);
　?、跜組肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)，但仍有較B組稍多的炎癥細(xì)胞聚集;
　　④D組肝組織結(jié)構(gòu)亦能見到恢復(fù)，但是炎癥浸潤(rùn)程度較治療組重;
　?、轃晒怙@微鏡下觀察標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:A、B兩組在肝組織內(nèi)可見一定數(shù)量被標(biāo)記的細(xì)胞，但占細(xì)胞總數(shù)中的比

13、例不大。
　　6.各治療組肝組織ALB、AFP含量的RT-PCR及電泳結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，三個(gè)治療組均有ALB及AFP的表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度依次為A組、B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.腹腔一次性注射1.4g/kg D-GalN能夠成功建立SD大鼠急性肝衰竭模型。
　　2.茵陳四苓顆粒與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植均能夠減輕急性肝衰竭大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝功能恢復(fù)和肝再生，中藥與干細(xì)

14、胞聯(lián)合治療的效果好于兩者單獨(dú)使用。
　　3.茵陳四苓顆粒與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在聯(lián)合治療急性肝衰竭模型大鼠上有協(xié)同作用，可能是通過兩者共同調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)信號(hào)通路和對(duì)抗細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。
　　4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注入急性肝衰竭大鼠肝內(nèi)可以促進(jìn)肝再生，使肝組織ALB及AFP表達(dá)增高，茵陳四苓顆粒聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療可以加強(qiáng)這一作用。
　　5.本次實(shí)驗(yàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過門靜脈輸入肝臟后在肝內(nèi)見到定植和增殖分化的細(xì)胞數(shù)不多，除