骨髓間充質干細胞治療大鼠脊髓損傷移植途徑的實驗研究.pdf

1、目的：通過損傷局部直接注射法、股靜脈注射法和腰椎穿刺法三種途徑移植骨髓間充質干細胞到大鼠脊髓損傷部位，觀察骨髓間充質干細胞對脊髓損傷大鼠神經功能恢復的影響，并比較、篩選適用于臨床應用的移植途徑。
　　 方法：
　　 1．取4只6周齡、體質量120-140g的健康SD大鼠，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，經過傳代、擴增至第五代行流式細胞儀鑒定。在細胞移植前48小時進行Brdu標記，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。<

2、br>　　 2.48只SD大鼠采用改良Allen's打擊法建立T10脊髓損傷模型，成功造模3天后隨機分為四組。A組：模型對照組不行細胞移植；B組：直接注射組在脊髓損傷部位上下位點注射骨髓間充質干細胞至損傷大鼠體內；C組：通過股靜脈將骨髓間充質干細胞移植到損傷大鼠體內；D組：通過腰椎穿刺將骨髓間充質干細胞移植到損傷大鼠體內。在細胞移植后3、7、14、21天四個時間點進行觀察。
　　 3．用運動神經功能BBB評分觀察大鼠后肢功能狀

3、態(tài)恢復的情況。
　　 4．在各時間點取大鼠脊髓組織，觀察損傷區(qū)病理學改變，并用免疫組化的方法檢測各組Brdu陽性細胞、Brdu+GFAP、Brdu+NF-200雙染陽性細胞，用專業(yè)圖像分析軟件計算各組GFAP、NF-200表達的平均光密度值。
　　 5．統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差記錄，使用統(tǒng)計學SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1．通過全

4、骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞在體外進行傳代、擴增，第五代細胞形態(tài)呈長梭形，漩渦狀排列，并且經過流式細胞儀檢測證實分離培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。
　　 2．A、B、C、D四組大鼠后肢運動功能逐漸恢復，在細胞移植7、14、21天后B、C、D三組的運動功能BBB評分較A組明顯增高，而且B組評分高于C、D兩組(P＜0.01)，D組運動功能評分高于C組(P＜0.01)。
　　 3．HE染色結果顯示，模型對照組脊髓

5、組織有較多壞死區(qū)域，神經元大量壞死，空泡較多，間質水腫明顯，而其它三個實驗組的壞組織死較小，空泡少，間質水腫較輕。
　　 4．B、C、D三組在細胞移植后均發(fā)現(xiàn)Brdu標記的陽性細胞，各時間點的B組細胞數(shù)目要顯著多于C、D兩組(P＜0.01)，而且經腰椎穿刺移植的D組陽性細胞數(shù)要多于經股靜脈移植的C組，差異具有統(tǒng)計學意義。在細胞移植后14天可以看到Brdu+GFAP雙染陽性的細胞，而Brdu+NF-200雙染陽性細胞出現(xiàn)在移植后2

6、1天，而且數(shù)量很少。使用專業(yè)圖像軟件分析得出：在細胞移植后GFAP和NF-200的平均光密度值都有增加，B、C、D三組與A組的差異具有統(tǒng)計學意義，而且三個實驗組之前也有差異，B組的值高于C、D兩組，D組要高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1．用全骨髓貼壁法可以在體外分離和培養(yǎng)骨髓間充質干細胞；
　　 2．直接注射、股靜脈注射和腰椎穿刺三種途徑移植的骨髓間充質干細胞均可在脊髓損傷處存