血紅素加氧酶-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減輕大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在建立穩(wěn)定的、可重復(fù)性強(qiáng)的大鼠異位小腸移植急性排斥反應(yīng)模型的基礎(chǔ)上，探討血紅素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs）在減輕大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng)，改善小腸移植大鼠預(yù)后中的作用。
　　方法：本研究首先采用梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法提取Lewis大鼠股骨及脛骨中的BMMSCs，培養(yǎng)至3代以后，通過轉(zhuǎn)染空腺

2、病毒（adenovirus，Ad）以及攜帶有HO-1基因的腺病毒制備腺病毒空載的BMMSCs（Ad/BMMSCs）和HO-1基因修飾的BMMSCs（Ad/HO-1/BMMSCs）；以BN大鼠為供體，以Lewis大鼠為受體，建立異位大鼠小腸移植排斥反應(yīng)模型。對(duì)照組供受體均為L(zhǎng)ewis大鼠。通過大鼠存活情況以及組織病理學(xué)變化分析小腸移植排斥反應(yīng)模型建模是否成功；在成功建模的基礎(chǔ)上，術(shù)后經(jīng)陰莖背靜脈分別給予未處理的 BMMSCs、Ad/BMM

3、SCs以及Ad/HO-1/BMMSCs各1×107個(gè)，等量的生理鹽水注射作為基礎(chǔ)對(duì)照。觀察術(shù)后各組大鼠的生存狀況并分析生存率。分別于術(shù)后1、5、7、10 d時(shí)搜集移植腸組織檢測(cè)組織病理學(xué)以及細(xì)胞凋亡情況，并通過免疫組織化學(xué)、Western Blot、PCR測(cè)定移植腸組織中HO-1蛋白以及mRNA的表達(dá)。同時(shí)，保留各組血清樣本檢測(cè)血清中各種細(xì)胞因子的水平。此外，提取脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)其中NK細(xì)胞（natural killer cell，NK

4、 cell）的活性以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的水平。
　　結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)鑒定，由大鼠股骨及脛骨提取的BMMSCs易培養(yǎng)、數(shù)量多、純度高，腺病毒轉(zhuǎn)染不會(huì)改變其生物細(xì)胞學(xué)特性；在反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)練習(xí)后熟練掌握小腸移植技術(shù)。在BN至Lewis的異位小腸移植急性排斥反應(yīng)模型中，術(shù)后3 d內(nèi)無明顯的急性排斥反應(yīng)發(fā)生，術(shù)后5 d時(shí)會(huì)發(fā)生輕至中度的急性排斥反應(yīng)，術(shù)后7 d時(shí)會(huì)發(fā)生中至重度的急性排斥反應(yīng)，而至術(shù)后

5、第10 d，所有的移植大鼠均表現(xiàn)為重度的急性排斥反應(yīng)。隨著急性排斥反應(yīng)的加重，移植小腸表現(xiàn)為越來越嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺窩上皮損傷、腺窩凋亡小體形成、組織結(jié)構(gòu)破壞以及粘膜潰瘍等。幾乎所有的移植大鼠均于14 d天之內(nèi)死亡，中位生存時(shí)間為10 d；BMMSCs治療顯著改善了移植大鼠地生存狀況并顯著提高了其術(shù)后生存率，組織病理學(xué)改變明顯改善，排斥指數(shù)、細(xì)胞凋亡及 NK細(xì)胞活性顯著下降。血清IL-10、TGF-β等與抗炎或 Tregs分化相關(guān)的

6、細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高，而與促炎或 Th17分化相關(guān)的細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及 IFN-γ的表達(dá)水平則明顯降低。此外，BMMSCs還誘導(dǎo)了Tregs的生成。但BMMSCs的以上效應(yīng)一般7 d內(nèi)較強(qiáng)，在10 d時(shí)便呈下降趨勢(shì)；HO-1基因修飾BMMSCs，顯著提高了BMMSCs中HO-1蛋白的表達(dá)，提高了BMMSCs在體內(nèi)的存活率，并進(jìn)一步增強(qiáng)了BMMSCs保護(hù)移植小腸的作用。與未處理的BMMS

7、Cs治療相比，Ad/HO-1/BMMSCs治療進(jìn)一步提高了移植大鼠術(shù)后生存率，組織病理學(xué)變化及細(xì)胞凋亡進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，NK細(xì)胞活性顯著下降而Tregs水平顯著升高，細(xì)胞因子 IL-10、TGF-β顯著上升而 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ則顯著降低。
　　結(jié)論：大鼠股骨、脛骨提取的BMMSCs數(shù)量多、純度高，是實(shí)驗(yàn)理想的BMMSCs來源；以腺病毒轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)BMMSCs的基因修飾是可行的；BMMSCs