受體源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠異位小腸移植慢性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、第一部分、大鼠小腸移植慢性排斥反應(yīng)模型的建立及病理學(xué)比較
　　 目的：采用F344-Lewis大鼠組合初步建立大鼠小腸移植慢性排斥反應(yīng)模型，觀測小腸組織慢性排斥病理表現(xiàn)。
　　 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建異系異位和異系原位大鼠小腸移植模型，術(shù)后0-14天給予皮下注射環(huán)孢素。術(shù)后90天進(jìn)行移植物活檢，常規(guī)病理學(xué)檢測。乳果糖/甘露醇比值、D-木糖吸收實驗檢測移植腸功能。
　　 結(jié)果：（1）異位和原位小腸移植大鼠均能長

2、期存活，大部分超過90天。（2）異位小腸移植在術(shù)后90天出現(xiàn)典型的慢性排斥反應(yīng)的病理學(xué)特征，包括粘膜結(jié)構(gòu)改變、間質(zhì)纖維化、白細(xì)胞浸潤和動脈內(nèi)膜增殖。（3）術(shù)后90天的原位移植小腸組織學(xué)形態(tài)相對正常。原位小腸移植大鼠在術(shù)后150天左右具有慢性排斥的病理組織學(xué)特征，但病變程度輕于術(shù)后90天的異位移植小腸。（4）大部分原位小腸移植大鼠在術(shù)后150天出現(xiàn)持續(xù)的體重下降，且不能被環(huán)孢素逆轉(zhuǎn)。當(dāng)體重下降超過30％時，乳果糖/甘露醇比值和D-木糖吸收

3、實驗結(jié)果證實移植腸功能下降。
　　 結(jié)論：（1）異位小腸移植在術(shù)后90天出現(xiàn)典型的慢性排斥反應(yīng)的病理學(xué)改變，而原位小腸移植在該時間點無慢性排斥反應(yīng)改變。（2）原位小腸移植于術(shù)后150天左右出現(xiàn)慢性排斥改變，以持續(xù)性體重下降為臨床表現(xiàn)，并伴隨腸道吸收功能以及屏障功能的下降。（3）F344-Lewis異位小腸移植手術(shù)操作相對簡單，經(jīng)練習(xí)后手術(shù)成功率可達(dá)85％以上。（4）由于異位小腸移植可以出現(xiàn)典型的慢性排斥反應(yīng)的組織病理學(xué)特征，故后

4、繼實驗采用F344-Lewis異位小腸移植模型，并根據(jù)組織病理學(xué)檢查結(jié)果確定術(shù)后90天為觀察終點。
　　 第二部分、大鼠異位小腸移植慢性排斥反應(yīng)的研究
　　 目的：建立大鼠異位小腸移植模型并研究相關(guān)慢性排斥反應(yīng)機(jī)理。
　　 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建同系和異系大鼠小腸移植模型，分為3組：同系移植組、異系移植組、異系治療組（給予環(huán)孢素）。分別在術(shù)后7天、14天、30天、60天、90天進(jìn)行移植物活檢，常規(guī)病理學(xué)檢測，

5、建立小腸移植排斥反應(yīng)組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用Real time-PCR技術(shù)檢測移植物內(nèi)TGFβ1、PDGF、PDGF-CmRNA轉(zhuǎn)錄水平，采用免疫組織化學(xué)方法檢測CD68、TFGFβ1、PDGF-C表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：（1）異系對照組全部大鼠均在術(shù)后15天內(nèi)死亡。（2）異系治療組自術(shù)后14天開始炎細(xì)胞浸潤程度病理評分顯著高于同期同系對照組，術(shù)后30天粘膜結(jié)構(gòu)變化以及纖維化程度病理評分顯著高于同期對照組，術(shù)后60天動脈內(nèi)膜增殖開始

6、有顯著差異（3）CD68檢測提示在慢性排斥反應(yīng)全程CD68的表達(dá)持續(xù)升高，術(shù)后60天達(dá)最高水平。（4）異系治療組的TGF-β1及PDGF-C mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平在第60天較同期的同系移植組顯著升高，免疫組化可見TFGF-β1在間質(zhì)高表達(dá)，PDGF-C主要由組織細(xì)胞高表達(dá)于胞漿及胞膜。
　　 結(jié)論：（1）術(shù)后第60天環(huán)孢素組的單核巨噬細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，同時伴TGFβ1、PDGF-C的高表達(dá)。（2）異系治療組術(shù)后60天即可出

7、現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)表現(xiàn)，并同時伴有CD68、TGFβ1、PDGF-C分子的顯著高表達(dá)，提示CD68、TGFβ1、PDGF-C對于判定慢性排斥反應(yīng)具有指導(dǎo)意義。
　　 第三部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：建立穩(wěn)定的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定方法，為進(jìn)一步開展研究MSCs對小腸移植慢性排斥反應(yīng)的影響提供細(xì)胞來源。
　　 方法：選用1月齡清潔級Lewis大鼠，處死消毒后取其長骨，用P

8、BS緩沖液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，采用密度梯度離心法分離獲取細(xì)胞，培養(yǎng)后取貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化制成細(xì)胞懸液計數(shù)并記錄生長曲線。取第3、4、5代生長狀態(tài)良好細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型。取第3代MSCs定向誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞，采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定。CFSE標(biāo)記第3代MSCs并觀察標(biāo)記效率。
　　 結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的原代MSCs72小時可見貼

9、壁細(xì)胞，3周左右可達(dá)到90％的融合，2代后即可得到較為純化的MSC成纖維樣細(xì)胞。（2）流式細(xì)胞儀檢測第3代MSCs表面標(biāo)記物CD29、CD90的陽性率可達(dá)96％以上，CD34、CD45的陽性率低于3％。（3）堿性磷酸酶染色和茜素紅染色結(jié)果證實成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。（4）用CFSE進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見幾乎所有MSCs均已被標(biāo)記綠色熒光，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示標(biāo)記比例達(dá)100％，提示CFSE標(biāo)記效率高。
　　 結(jié)論：（1）MS

10、Cs是一類增殖能力旺盛，具有多向分化潛能的干細(xì)胞。（2）密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法是一種簡便易行的培養(yǎng)MSCs方法，操作簡單，成功率高，可以作為培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs的常規(guī)方法。（3）CFSE標(biāo)記可作為標(biāo)記MSCs的一種有效手段。
　　 第四部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外免疫抑制功能的實驗研究
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)中對同種異體脾細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

11、r>　　 方法：建立MSCs和同種異體脾細(xì)胞共培養(yǎng)體系，反應(yīng)體系總量300ul，以刀豆蛋白A為刺激因素，CFSE標(biāo)記部分反應(yīng)細(xì)胞。共分4組：①脾細(xì)胞，②脾細(xì)胞+conA，③脾細(xì)胞+MSCs，④脾細(xì)胞+MSCs+conA，每組6復(fù)孔，每孔脾細(xì)胞數(shù)5×105個，MSCs為105個，ConA終濃度為10ug/ml?；旌吓囵B(yǎng)72小時后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度以及CD4、CD8比例。
　　 結(jié)果：MS

12、Cs和脾細(xì)胞共培養(yǎng)組未見明顯的增殖子峰，其中CD4、CD8陽性細(xì)胞表達(dá)明顯下降，而CD4/CD8比值無明顯變化。
　　 結(jié)論：骨髓MSCs體外能夠抑制刀豆蛋白A引起的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，對CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞均有抑制作用。
　　 第五部分、受體源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠異位小腸移植慢性排斥反應(yīng)的影響
　　 目的：研究靜脈輸注受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對大鼠異位小腸移植慢性排斥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。
　

13、　 方法：利用顯微外科技術(shù)構(gòu)建異系小腸移植模型16只，隨機(jī)分為2組：對照組和MSCs輸注組。小腸移植后24小時，確定手術(shù)成功后，MSCs組自陰莖背靜脈輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞107個（溶液為2ml生理鹽水），對照組給予同體積的生理鹽水，術(shù)后0～14天兩組均給予環(huán)孢素處理。觀察兩組移植大鼠術(shù)后生存狀態(tài)，于術(shù)后第60天全部剖殺獲取移植小腸。常規(guī)病理學(xué)檢測，進(jìn)行慢性排斥反應(yīng)病理評分。應(yīng)用Realtime-PCR技術(shù)檢測移植物內(nèi)TGFβ1、PDG

14、F-CmRNA轉(zhuǎn)錄水平，采用免疫組織化學(xué)方法檢測CD68、TGFβ1、PDGF-C表達(dá)情況。另外再建立兩只大鼠異位小腸移植模型，給予環(huán)孢素處理，術(shù)后24小時給予陰莖背靜脈輸注標(biāo)記了熒光CFSE的骨髓MSCs，術(shù)后7天剖殺獲取移植小腸以及自體其他組織器官備冰凍切片檢查以觀察MSCs在受體內(nèi)的定位。
　　 結(jié)果：（1）輸注的骨髓MSCs可特異的定向遷移至移植小腸。（2）術(shù)后60天MSCs組小腸標(biāo)本的粘膜結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤、纖維化程度和