鞘氨醇激酶-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的： 目前已有多項基礎(chǔ)和臨床研究證實骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)移植可修復受損心肌、顯著改善心肌梗死后心功能，但由于不適應缺血缺氧、炎癥、凋亡因子等惡劣的宿主環(huán)境，移植細胞的90％以上在短期內(nèi)死亡，這大大降低了干細胞在心肌損傷修復中的效果。因此，選擇合適的基因?qū)SC進行修飾可能是提高細胞的移植存活率和治療效果的一條有效途徑。 鞘氨醇激酶-1(SPK1)是近年來受到廣泛關(guān)注的一種與細胞生命活動調(diào)節(jié)密切相關(guān)的蛋白

2、激酶，它通過調(diào)節(jié)鞘磷脂代謝平衡對細胞生長、分化和程序性死亡起重要作用，其催化產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇有促進細胞增殖及血管新生的作用。我們的前期研究已證實，腺病毒介導SPK1基因(Ad-SPK)心肌內(nèi)注射能有效地抑制心臟缺血-再灌注損傷、減輕缺血性心力衰竭。因此我們推斷，SPK1基因轉(zhuǎn)導可起到增加MSC移植細胞存活率、進一步改善缺血性心臟病心功能的作用。本課題旨在研究腺病毒介導的SPK1基因修飾對骨髓MSC的移植存活率以及對缺血性心臟病心功能的

3、影響，明確SPK1基因修飾MSC移植治療急性心肌梗死可行性和有效性，為今后臨床研究奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： 1.2周齡wistar大鼠，采用Percoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法，自股骨和脛骨骨髓中分離培養(yǎng)MSC，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并通過體外向成骨細胞和成脂細胞誘導分化間接鑒定MSC；流式細胞儀檢測攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體(Ad-GFP)感染MSC的效率。 2．用293細胞擴增、氯化銫密度梯度離心

4、法純化Ad-SPK，TCID50法測病毒滴度；根據(jù)不同感染強度(MOI)的Ad-SPK體外感染MSC48小時后SPK1蛋白表達及酶活性的變化確定Ad-SPK感染MSC的最佳感染強度，并以此強度感染MSC后不同時間測定SPK1的蛋白表達及酶活性，確定SPK1的表達時效。 3．體外研究轉(zhuǎn)染SPK1基因?qū)SC細胞增殖、細胞周期及成脂、成骨細胞分化能力的影響，以及對抗去血清凋亡能力的變化。 4．用分子克隆的方法構(gòu)建螢火蟲熒光素

5、酶基因(fluc)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體[pL(fluc)SN]，篩選穩(wěn)定表達fluc報告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞GPE+86和PA317，測定病毒滴度并檢測包裝細胞熒光素酶活性。 5．用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導fluc報告基因標記小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，應用活體成像技術(shù)觀察MSC移植入小鼠正常的骨骼肌后在體存活情況。 6．用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導fluc報告基因標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，應用生物發(fā)光技術(shù)檢測SPK1修飾或不修飾的MSC

6、移植到大鼠缺血心臟后的存活情況。 7．結(jié)扎左前降支建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型，結(jié)扎后30分鐘于缺血區(qū)分四點心肌內(nèi)注射1×106/0.1ml的SPK1修飾的MSC(MSC-SPK組)、GFP標記的MSC(MSC-GFP組)、PBS(AMI組)，每組10只，另取5只假手術(shù)作為對照(SHAM組)。監(jiān)測細胞移植后血流動力學、血漿心房利鈉肽(ANP)、超聲心功能、心室重構(gòu)、血管新生等的變化。 結(jié)果： 1．自Wist

7、ar大鼠骨髓分離的MSC貼壁生長，呈成纖維細胞樣，原代細胞7-10天可達到80％融合生長，傳代細胞生長旺盛，生長曲線示3天生長可達高峰，經(jīng)特殊誘導劑誘導后可向成骨細胞和成脂細胞分化。Ad-GFP感染MSC48小時后的感染效率高達97.82％。 2．在293細胞中大量擴增攜帶SPK1的重組腺病毒，經(jīng)氯化銫密度梯度超速離心后獲得病毒滴度約6×1010IU/ml；以不同梯度MOI感染MSC48小時后SPK1蛋白表達及細胞內(nèi)SPK1酶活

8、性確定Ad-SPK感染MSC的最佳強度為150pfu/cell，蛋白表達持續(xù)至少10天，并維持較高的酶活性。 3．SPK1基因轉(zhuǎn)染對MSC的細胞增殖能力、細胞周期、成骨及成脂分化潛能無顯著影響，但去血清培養(yǎng)48小時MSC-SPK較MSC早期及晚期凋亡數(shù)目顯著降低(48.75％VS17.44％，P＜0.01)。 4．成功構(gòu)建熒光素酶逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，并篩選出穩(wěn)定表達熒光素酶、產(chǎn)病毒滴度較高的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞(GP+E8

9、6/fluc及PA317/fluc)。 5．應用rv-fluc感染小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，初步應用活體成像技術(shù)觀察MSC移植入正常的骨骼肌后在體存活情況，顯示MSC移植后3天細胞存活不足10％。 6．應用fluc標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，體外應用Ad-GFP或Ad-SPK修飾后移植入缺血心肌，研究發(fā)現(xiàn)隨著移植時間的延長細胞存活數(shù)目逐漸減少，3天內(nèi)移植細胞死亡率高達90％以上，但SPK1基因修飾可改善MSC移植早期(5天內(nèi))

10、存活率。 7．急性心肌梗死后大鼠血流動力學惡化，左心室擴張、球形變，非梗死區(qū)膠原增生纖維化，血漿心鈉肽水平增加，心功能嚴重受損；MSC-GPF及MSC-SPK移植均可有效改善大鼠的血流動力學，降低左室舒張末壓，減少非梗死區(qū)膠原沉積，增加新生血管密度，降低心鈉肽，改善左心功能；MSC-SPK較MSC-GFP移植能進一步降低左室舒張末壓、縮小梗死面積，促進血管新生，抑制左心室的球形變。 結(jié)論： 1．骨髓MSC分離方法

11、簡便，體外擴增容易，有多向分化潛能，體外腺病毒載體感染效率高，是理想的組織工程及基因工程種子細胞。 2．腺病毒載體介導SPK1基因可高效轉(zhuǎn)染MSC，穩(wěn)定表達目的基因，持續(xù)時間適中，對MSC的生長周期、增殖及分化能力無明顯影響，是適宜的基因轉(zhuǎn)移載體。 3．骨髓間充質(zhì)干細胞移植入正常或缺血組織后早期移植細胞死亡率均較高，達90％以上；SPK1修飾的MSC雖在體外抗去血清凋亡能力顯著增強；但移植入缺血心肌后僅可改善移植早期(5