經(jīng)冠狀動(dòng)脈自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction，AMI)是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的臨床常見(jiàn)病?，F(xiàn)有的心肌梗塞內(nèi)科藥物治療及血運(yùn)重建治療方法存在著無(wú)法逆轉(zhuǎn)梗死期壞死的心肌，對(duì)終末期心力衰竭療效差的缺陷。而心臟移植作為治療終末期心衰的有效手段，也存在著價(jià)格昂貴、供體來(lái)源有限、免疫排斥等問(wèn)題，難以臨床廣泛應(yīng)用。最近，隨著對(duì)干細(xì)胞(stemcell)研究的不斷深入，采用生物學(xué)技術(shù)將不同組織來(lái)源的干細(xì)胞，在體外分離、

2、培養(yǎng)、擴(kuò)增后，通過(guò)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行干細(xì)胞移植治療，以期替代、修復(fù)或改善受損心肌組織的生物學(xué)功能的心肌細(xì)胞重塑治療(Cellularecardiomyoplasty,CCM)作為一種治療心臟疾病的全新模式，可能成為心肌梗死治療的“捷徑”，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。其中，尋找細(xì)胞移植治療的理想種子細(xì)胞是心肌細(xì)胞重塑治療的關(guān)鍵。 研究目的通過(guò)對(duì)以下幾方面問(wèn)題的研究：1)優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，

3、MSCs)的分離、純化、擴(kuò)增的方法；2)觀(guān)察MSCs在體外誘導(dǎo)分化為功能性心肌細(xì)胞的能力；3)建立小型豬AMI模型，模擬AMI患者臨床成功血運(yùn)重建治療后經(jīng)冠狀動(dòng)脈干細(xì)胞移植的情況；4)探討MSCs對(duì)心臟功能的影響及移植的適宜條件。評(píng)價(jià)經(jīng)冠狀動(dòng)脈MSCs移植治療AMI的療效，為臨床治療AMI，防治心肌壞死、纖維化而導(dǎo)致的左室重構(gòu)、心力衰竭提供新的、安全、有效的、可行的手段。 方法與結(jié)果本實(shí)驗(yàn)第一部分為小型豬骨髓MSCs的分離培養(yǎng)與

4、體外誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞。優(yōu)化了小型豬骨髓MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增的條件，探討MSCs生物學(xué)特性，比較不同濃度5-氮胞苷(5-azacytide，5-aza)對(duì)培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs體外向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的能力的影響。采用密度梯度離心的方法，應(yīng)用密度為1.073g/mL的Percoll淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)DMEM/F12(Dulbecco，smodifiedEagle，smedium-F12)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，MSCs

5、生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈S形，符合正常細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，倍增時(shí)間約為24h。擴(kuò)增后的MSCs分別加入5μmol/L和10μmol/L的5-aza進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)分化，陰性對(duì)照組采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)5-aza進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)，誘導(dǎo)后14天時(shí)細(xì)胞首尾相連，形成多核肌管樣結(jié)構(gòu)。10μmol/L的5-aza誘導(dǎo)分化效率較高，轉(zhuǎn)化率分別為38.2±5.2％vs24.4±4.3％，P＜0.01。 本實(shí)驗(yàn)第二部分為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)自體MSCs移植治療小

6、型豬AMI模型及療效分析。通過(guò)結(jié)扎小型豬冠狀動(dòng)脈左前降支(Leftanteriordescendingbranch，LAD)90分鐘后恢復(fù)血流的方法建立AMI模型，造模過(guò)程與人類(lèi)AMI的發(fā)病機(jī)制相似，并模擬了臨床急診溶栓或PCI術(shù)成功后的情況。造模后10-14天后將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的自體MSCs經(jīng)冠狀動(dòng)脈植入梗死區(qū)，應(yīng)用超聲心動(dòng)圖了解移植前后心功能變化情況，冰凍切片熒光顯微鏡示蹤DAPI標(biāo)記的供體MSCs，Ⅷ因子免疫熒光染色測(cè)定新生血管密度

7、。移植術(shù)后3個(gè)月，MSCs治療組與對(duì)照組比較，EF值顯著升高(54.65±3.39％vs43.98±4.21％，P＜0.01)，MSCs治療組與對(duì)照組比較新生血管密度顯著升高(13.28±4.39vs4.27±2.28,P＜0.01)。 結(jié)論1.MSCs具有良好的生物學(xué)特性，是再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)秀種子細(xì)胞。利用自主建立的技術(shù)平臺(tái)，優(yōu)化了MSCs分離、純化的技術(shù)，在短期內(nèi)可以獲得相當(dāng)數(shù)量的生物性狀穩(wěn)定的MSCs，為心臟病生物學(xué)治療的發(fā)展

8、提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。 2.建立了對(duì)MSCs進(jìn)行科學(xué)評(píng)估的技術(shù)平臺(tái)，MSCs在體外經(jīng)5-aza定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，確定了MSCs的心肌分化潛能。3.阻斷小型豬冠狀動(dòng)脈LAD血流90分鐘后再灌注，可以造成灶性心肌梗死模型，較好的模擬了人類(lèi)AMI及成功再灌注治療的情況，為MSCs移植治療提供了良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?4.在AMI造模10-14天后進(jìn)行經(jīng)冠狀動(dòng)脈MSCs自體移植，MSCs可以在梗死局部存活并向心肌細(xì)胞分化，增加了