大豆苷原對(duì)骨形成的量效作用及Ers-PPARγ的調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病率逐年增高，雌激素替代治療(estrogen replacement therapy，ERT)雖能減少絕經(jīng)后婦女的骨丟失及骨折發(fā)生率，但由于長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)性增加等安全問題使其應(yīng)用受到限制。大豆苷原(daidzein，DAI)是一種常見的植物雌激素(phytoestrogen，PE)，有雌激素樣效應(yīng)而無雌

2、激素樣副作用，近年來引起了人們廣泛關(guān)注。最近的研究提示植物雌激素的骨保護(hù)作用具有劑量依賴性的雙相作用特點(diǎn)，其機(jī)制尚不清楚，雌激素受體(estrogen receptors，ERs)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors gamma，PPARγ)可能參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)制，但相關(guān)研究報(bào)道較少，具體作用機(jī)制也不清楚。
　　第一部分大豆苷原防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的

3、量效作用及其對(duì)骨髓細(xì)胞ERs和PPARγ表達(dá)的影響
　　目的：
　　研究不同劑量大豆苷原對(duì)去卵巢大鼠血清E2、ALP、脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)，骨密度(BMD)，以及對(duì)骨髓細(xì)胞ERα、ERβ和PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，探討大豆苷原防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的量效作用，及其對(duì)骨髓細(xì)胞ERs和PPARγ表達(dá)的影響。
　　方法：
　　將3月齡SD(Sprague Dawley

4、)雌性大鼠(由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組(sham)、去卵巢組(行雙側(cè)卵巢切除ovariectomy，OVX)、去卵巢+戊酸雌二醇組(E2，戊酸雌二醇800μg/kg·d)、去卵巢+高劑量大豆苷原組(H-DAI，大豆苷原200 mg/kg·d)、去卵巢+中劑量大豆苷原組(M-DAI，大豆苷原50 mg/kg·d)和去卵巢+低劑量大豆苷原組(L-DAI，大豆苷原10 mg/kg·d)，除假手術(shù)組外，其余大鼠均切除卵

5、巢，術(shù)后4周開始以相應(yīng)的藥物灌胃，3月后處死大鼠。取血清檢測(cè)E2、ALP、脂聯(lián)素及瘦素水平；取腰椎骨L1-5和左股骨檢測(cè)骨密度后，脫鈣行骨切片HE染色觀察骨組織形態(tài)。從右股骨骨髓腔內(nèi)提取出骨髓細(xì)胞，Realtime-RT-PCR方法檢測(cè)骨髓細(xì)胞ERα、ERβ和PPARγ mRNA表達(dá)，western blot法檢測(cè)ERα、ERβ和PPARγ蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、E2組和L-DAI組血清E2、ALP、adipon

6、ectin及l(fā)eptin濃度顯著高于OVX組(P<0.05)；除了leptin濃度外，L-DAI組血清E2、ALP、adiponectin濃度顯著高于E2組(P<0.05)。H-DAI和M-DAI組間血清E2、ALP、adiponectin及l(fā)eptin濃度無顯著差異(P>0.05)，均顯著低于E2和L-DAI組(P<0.05)。
　　2、sham組大鼠的左股骨及腰椎BMD均顯著高于其他各組(P<0.05)。L-DAI組大鼠左股骨

7、及腰椎BMD均比OVX組顯著增高(P<0.05)，且E2組無顯著性差異(P>0.05)。M-DAI組大鼠股骨BMD顯著高于OVX組(P<0.05)，與E2及L-DAI組無顯著性差異(P>0.05)；M-DAI組腰椎BMD與OVX組無顯著性差異(P>0.05)。H-DAI組大鼠的左股骨及腰椎BMD顯著低于L-DAI組(P<0.05)，與OVX組無明顯差異(P>0.05)。
　　3、大鼠左股骨及腰椎骨組織形態(tài)：與sham組比較，OVX

8、組骨小梁數(shù)量顯著降低，脂肪細(xì)胞顯著增多。E2可增加骨小梁數(shù)量，減少脂肪細(xì)胞。大豆苷原三個(gè)劑量組中，L-DAI組可顯著增加骨小梁數(shù)目及抑制脂肪生成；隨著大豆苷原劑量的增加，骨小梁數(shù)量顯著遞減，脂肪細(xì)胞顯著遞增。
　　4、L-DAI組大鼠骨髓細(xì)胞的ERα mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著高于M-DAI和H-DAI組(P<0.05)，較E2、OVX和sham組增高，但差異不顯著(P>0.05)，各組ERβ mRNA及蛋白表達(dá)量均低于ERα表達(dá)

9、量，6組的ERβmRNA及蛋白表達(dá)水平未見明顯組間差異。H-DAI組大鼠骨髓細(xì)胞的PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于M-DAI和L-DAI組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、大豆苷原對(duì)骨產(chǎn)生雌激素樣作用，對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥有防治作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，低劑量時(shí)效果與雌二醇相當(dāng)，高劑量時(shí)無骨保護(hù)作用。
　　2、大鼠骨髓細(xì)胞均表達(dá)ERα和ERβ，但以ERα為主，提示ERα在骨保護(hù)作用中可能發(fā)揮主要作用

10、。
　　3、大豆苷原三個(gè)劑量組中，低劑量組大鼠骨髓細(xì)胞ERα表達(dá)顯著高于中、高劑量組，提示低劑量大豆苷原對(duì)骨的保護(hù)作用可能是通過ERα來介導(dǎo)的。高劑量組大鼠骨髓細(xì)胞PPARγ表達(dá)顯著高于中、低劑量組，提示高劑量大豆苷原可能通過作用于PPARγ，導(dǎo)致骨量減少及骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多。
　　4、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大豆苷原低劑量時(shí)可顯著提高血清脂聯(lián)素與瘦素水平，提示脂聯(lián)素及瘦素可能參與了對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用。
　　第二部分大豆苷

11、原對(duì)人類成骨細(xì)胞骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　目的：
　　研究不同濃度大豆苷原(daidzein，DAI)對(duì)成骨細(xì)胞骨形成的量效作用，及雌激素受體(estrogen receptors，ERs)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)對(duì)DAI骨形成的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　?、僖耘囵B(yǎng)的未經(jīng)

12、處理的人類胎兒成骨細(xì)胞(human fetal osteoblast，hFOB)為對(duì)照組(Ctrl組)，用17β-戊酸雌二醇(β-estradiol-17-valerate，E2)和不同濃度DAI分別處理hFOB72小時(shí)后，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，PNPP法測(cè)定成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。②用ERs拮抗劑ICI182780、ERα拮抗劑MPP、PPARγ拮抗劑GW9662分別阻斷受體ERs、ERα和PPARγ后，再給予E2及不同

13、濃度的DAI處理，MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況并計(jì)算細(xì)胞增殖率，PNPP法測(cè)定ALP水平。③選用高低濃度的大豆苷原分別處理hFOB后，實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)ERα、ERβ和PPARγ mRNA表達(dá)水平，western blot法檢測(cè)ERα、ERβ和PPARγ蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、隨著DAI劑量的增加，成骨細(xì)胞增殖率遞減，DAI10-9mol/L組較對(duì)照組顯著升高，DAI10-5mol/L組較對(duì)照組顯著降低(

14、P<0.05)。隨著DAI劑量的增加，成骨細(xì)胞ALP水平遞減；但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2、ICI阻滯ERs后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L組的細(xì)胞增殖率分別為88.16％、76.30％、81.18％、83.19％，均顯著低于阻滯前(P<0.05)；MPP單純阻滯ERα后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L組的細(xì)胞增殖率分別為69.7

15、8％、63.31％、70.71％、78.43％，均顯著低于阻滯前(P<0.05)。MPP阻滯后，DAI10-9mol/L組的ALP水平顯著低于阻滯前(P<0.05)。
　　3、GW阻滯PPARγ后，E2、DAI10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L組的細(xì)胞增殖率分別是103.14％、96.99％、112.88％和122.22％，其中DAI10-7、10-5 mol/L組均較阻滯前顯著升高(P<0.05)，D9組

16、輕度降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DAI10-5 mol/L組的ALP水平較阻滯前顯著增加(P<0.05)。
　　4、E2及DAI10-9mol/L組的ERα mRNA表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，均顯著高于DAI10-5mol/L組(P<0.05)。DAI10-5mol/L組PPARγ mRNA表達(dá)量顯著高于E2組(P<0.05)。
　　5、與其余各組比較，DAI10-9mol/L組ERα蛋白表達(dá)水平顯著增加

17、，DAI10-5mol/L組PPARγ蛋白表達(dá)水平明顯增加。
　　6、ERβ mRNA及蛋白表達(dá)量在Ctrl、DAI10-9mol/L、DAI10-5mol/L組中均低量表達(dá)，各組間均無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1、DAI的骨保護(hù)作用具有劑量依賴性的雙相作用特點(diǎn)：低劑量DAI促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，高劑量DAI抑制成骨細(xì)胞增殖和分化。
　　2、低劑量DAI可能主要通過作用于ERα促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，對(duì)PPA

18、Rγ的作用不明顯。
　　3、高劑量DAI可能主要通過作用于PPARγ抑制成骨細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)也可通過作用于ERs產(chǎn)生一定促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。
　　4、E2對(duì)PPARγ無作用；低劑量大豆苷原可能通過ERβ對(duì)成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生負(fù)性作用。
　　總結(jié)：
　　1、大豆苷原對(duì)骨質(zhì)疏松癥有防治作用，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，低劑量時(shí)效果明顯，高劑量無明顯作用。
　　2、低劑量大豆苷原可能主要作用于ERα，表現(xiàn)為骨生成增加