毛冬青皂苷調(diào)節(jié)大鼠高脂血癥作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　高脂血癥是一種脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，其特征是血液中一種或多種脂質(zhì)或脂蛋白水平異常。通常，高脂血癥的發(fā)生與遺傳、環(huán)境及飲食習(xí)慣有關(guān)。其中，飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂是引發(fā)高脂血癥的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。從食物中攝取過(guò)多的脂質(zhì)及體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常均可誘發(fā)高脂血癥。流行病學(xué)研究與臨床試驗(yàn)表明高脂血癥可誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、腦梗等一系列心腦血管疾病?，F(xiàn)如今，在中國(guó)的農(nóng)村和城市由心血管系統(tǒng)疾病所導(dǎo)致的死亡率分別占41.09％和4

2、1.52％。同樣，在美國(guó)大約也有1/6的人群患有高脂血癥。隨著全球心血管疾病發(fā)病率的增加，如何預(yù)防和治療高脂血癥已經(jīng)成為整個(gè)醫(yī)學(xué)界的首要問題和巨大挑戰(zhàn)。臨床應(yīng)用的一線調(diào)整藥如他汀類、貝特類，可快速有效的降低血清脂質(zhì)水平。然而，由于部分高脂血癥患者在使用過(guò)程中出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)及其依賴性使其臨床應(yīng)用受到了限制。與此相比，天然產(chǎn)物及其衍生物在預(yù)防和治療高脂血癥中可能具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合作用，發(fā)揮出獨(dú)特的療效，并且多部分天然藥物的不良反應(yīng)

3、相對(duì)輕微、且來(lái)源廣泛、成本低等優(yōu)勢(shì)。
　　毛冬青皂苷(Pedunculo side，PE)，提取自冬青科冬青屬植物鐵冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥樹皮，為五環(huán)三萜類化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有清熱解毒，消腫止痛功效。用于感冒，扁桃體炎，咽喉腫痛，急性胃腸炎，風(fēng)濕骨痛;外用治跌打損傷，癰癤瘡瘍，外傷出血，燒燙傷等。本論文研究PE的調(diào)脂活性并初步探討其潛在的作用機(jī)制，為天然調(diào)脂藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

4、方法：
　　第一部分:預(yù)試驗(yàn)，高脂飲食建立高脂血癥動(dòng)物模型，確定試驗(yàn)動(dòng)物、高脂飼料配方、造模周期，建立合理、安全、有效的高脂血癥動(dòng)物模型。
　　第二部分:建立高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠模型，灌胃給予受試藥PE(5，15，30 mg/kg/d)及陽(yáng)性對(duì)照藥辛伐他汀(Simvastatin，Sim10 mg/kg/d)，連續(xù)7周。試驗(yàn)期間，每周測(cè)量大鼠體重、攝食量。試驗(yàn)從第3周至第7周，每周測(cè)定大鼠血清脂質(zhì)含量。試驗(yàn)結(jié)束，處死大

5、鼠，測(cè)定肝臟組織中TC、TG含量。制作肝臟及脂肪切片，觀察PE對(duì)肝臟中脂質(zhì)浸潤(rùn)及脂肪細(xì)胞的影響。RT-PCR測(cè)定肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。分離大鼠心、肝、脾、肺、腎、脂肪，稱重、計(jì)算臟器系數(shù)并且進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查，觀察有無(wú)病理改變。
　　第三部分:體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，MTT法檢測(cè)PE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖活性的影響。使用含胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methyl

6、xanthine，IBMX)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成熟，誘導(dǎo)期間使用不同濃度PE干預(yù)。誘導(dǎo)結(jié)束測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG含量，油紅O染色。
　　第四部分:誘導(dǎo)分化第9天，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot測(cè)定CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白α（CCAAT-enhancer-binding proteins-α，C/EBPα）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated recep

7、tor-γ，PPAR-γ)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(Sterolregulatory element-binding protein-1，SREBP-1)脂肪分化相關(guān)蛋白表達(dá)及AMPK信號(hào)通路的活化。
　　結(jié)果：
　　第一部分:SD大鼠給予高脂飼料（67.5％基礎(chǔ)飼料，10％豬油，10％蛋黃粉，10％蔗糖，2％膽固醇，0.5％膽鹽）喂養(yǎng)4周，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著

8、降低(p＜0.001)。肝臟體積增大且肝細(xì)胞中有大量脂肪浸潤(rùn)，表明成功構(gòu)建高脂血癥大鼠模型。
　　第二部分:PE5、15、30mg/kg可顯著降低大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，并且顯著升高血清HDL-C含量(p＜0.001)。5、15、30mg/kg PE對(duì)大鼠肝臟組織勻漿TC、TG含量亦有顯著降低作用(p＜0.001)。肝組織H&E及油紅O染色結(jié)果顯示PE可顯著改善肝臟組織脂質(zhì)浸潤(rùn)。PE15、30mg/kg可顯著降低脂肪重

9、量(p＜0.05，p＜0.01)及脂肪直徑(p＜0.001)。RT-PCR結(jié)果顯示PE5、15、30mg/kg可顯著下調(diào)肝組織中SREBP-1c、FAS、SCD-1基因表達(dá)(p＜0.001)，PE30mg/kg對(duì)PPAR-α基因表達(dá)有顯著上調(diào)作用(p＜0.001)。此外，組織形態(tài)學(xué)檢查重要臟器未見異常。
　　第三部分:MTT結(jié)果顯示PE在25-100pμmol/L濃度范圍時(shí)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，表明PE在該濃度范

10、圍內(nèi)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)毒性。PE25、50、100μmol/L可顯著降低脂肪細(xì)胞內(nèi)TG含量(p＜0.001)，且呈劑量依賴性。油紅O染色結(jié)果顯示PE顯著減少成熟脂肪細(xì)胞中脂滴數(shù)量。
　　第四部分:Western Blot結(jié)果顯示PE25、50、100μmol/L可顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞中PPAR-γ蛋白表達(dá)(p＜0.01，p＜0.001)。PE50、100μmol/L對(duì)脂肪細(xì)胞中C/EBPα、SREBP-1蛋白表達(dá)也有顯著的下調(diào)

11、作用(p＜0.01，p＜0.001)。此外，PE25、50、100μmol/L可顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞中p-AMPK蛋白表達(dá)(p＜0.01, p＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　(1) PE可顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，顯著改善肝組織脂肪浸潤(rùn)。
　　(2)PE可通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟中脂質(zhì)生成及脂肪酸β氧化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠高脂血癥。(
　　3) PE