CITP的Th細(xì)胞極化狀態(tài)及PPAR-γ對(duì)Th細(xì)胞分化調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、【目的】 1.探討CITP是一種Th1/Th2細(xì)胞失衡相關(guān)(Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì))的自身免疫病。研究CITP患者外周血中Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10的水平，探討CITP的Th細(xì)胞的偏移方向。 2.探討CITP患者Th1/Th2細(xì)胞分化狀態(tài)的指標(biāo)。研究CITP患者外周血T淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子T-bet和GATA-3 mRNA的表達(dá)情況，比較T-bet/GATA-3比值與IFN-γ/IL-10比值的意義，及

2、研究它們與Th1/Th2細(xì)胞分化失衡的相關(guān)性。 3.探討配體活化的PPAR-γ對(duì)Jurkat T細(xì)胞T-bet/GATA-3表達(dá)的影響，及其與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞失衡之間具體的作用機(jī)制。 【方法】 1.外周血T淋巴細(xì)胞的分離取CITP患者及正常對(duì)照體檢者外周靜脈血，枸椽酸鈉抗凝。淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞，置玻璃培養(yǎng)皿中37℃孵育30min去除單核細(xì)胞，加入0.85％NH4Cl溶液溶解紅細(xì)胞，經(jīng)T

3、細(xì)胞分離富聚柱獲得純化的T細(xì)胞。加入10％新生牛血清Hanks液重懸T細(xì)胞，調(diào)整T細(xì)胞濃度至2×106/ml。FITC標(biāo)記的抗CD3單克隆抗體檢測(cè)其純度，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)其活性。 2.Th1及Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子含量的檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)測(cè)定血清中IFN-γ、IL-10的水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以450nm比色，測(cè)吸光度(OD)值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣本濃度，以pg/ml表示。 3.T細(xì)

4、胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)T淋巴細(xì)胞懸液抽提總RNA，RT-PCR一步法特異性提取T-bet、GATA-3mRNA，以β-actin為內(nèi)參，瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描T-bet/GATA-3 mRNA的條帶，得條帶灰度值，以T-bet/β-actin、GATA-3/β-actin的灰度比值表示其mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。 4.PPAR-γ調(diào)節(jié)Th1/Th2分化與T-

5、bet/GATA-3途徑的關(guān)系Jurkat T細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)。PHA(5μg/ml)活化Jurkat T細(xì)胞24h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮(不同濃度)分別與Jurkat T細(xì)胞細(xì)胞混合培養(yǎng)，為探討實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為PPAR-γ依賴(lài)性，每個(gè)濃度的吡格列酮組均多設(shè)一個(gè)加有PPAR-γ,特異性拮抗劑GW9662(終濃度為10 μM)的實(shí)驗(yàn)組，先于吡格列酮一個(gè)小時(shí)加入

6、。12h，24h，48h后按上述方法分別檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)譜及T-bet和GATA-3 mRNA表達(dá)的變化。探討PPAR-γ/激動(dòng)劑和T-bet/GATA-3途徑對(duì)Th1/Th2分化的調(diào)節(jié)作用。 [結(jié)果] 1.分離純化所得T淋巴細(xì)胞的純度和活性均大于95％。 2.與正常對(duì)照組相比，CITP患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比例明顯升高。IFN-γ含量高于正常對(duì)照組、而IL-10水平卻低于正常組。

7、 3.與正常對(duì)照組相比，CITP患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA的表達(dá)增加，而GATA-3的表達(dá)反而降低。 4.PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)Jurkat T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10的表達(dá)均起抑制作用，抑制T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)，并具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。而GW9662(PPAR-γ特異拮抗劑)可緩解吡格列酮抑制IFN-γ分泌及T-bet mRNA表達(dá)，但對(duì)于IL-10、GATA-3

8、mRNA的受抑程度則無(wú)明顯影響。 [結(jié)論] 1.本研究所采用的T細(xì)胞分離純化方法可用于科學(xué)研究。 2.CITP是一種Th1/Th2細(xì)胞失衡相關(guān)(Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì))的自身免疫??；作為反映CITP患者Th1/Th2細(xì)胞分化狀態(tài)的指標(biāo)，T-bet/GATA-3比值較IFN-γ/IL-10比值更有靈敏度和準(zhǔn)確性。 3.CITP患者Th1優(yōu)勢(shì)，即呈現(xiàn)細(xì)胞免疫亢進(jìn)狀態(tài)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞增多，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，或自身

9、反應(yīng)性T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞毒作用直接破壞血小板；且Th1型細(xì)胞因子IFN-γ等生成增加，加速了巨噬細(xì)胞的活化，單核巨噬吞噬功能增強(qiáng)，加劇了對(duì)血小板清除作用，從而使得CITP病情的發(fā)生與發(fā)展。 4.PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮抑制Jurkat T細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖及細(xì)胞因子的表達(dá)。其抑制Th0向Th1細(xì)胞分化是PPAR-γ依賴(lài)性通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子T-bet進(jìn)行調(diào)節(jié)。而相關(guān)對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用，則非PPAR-γ,依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3途徑相關(guān)進(jìn)