Rab23對(duì)UVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：光線性角化病是一種臨床常見(jiàn)的皮膚癌前期病變，常見(jiàn)于中老年人，可發(fā)展為皮膚鱗狀細(xì)胞癌。目前光線性角化病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，長(zhǎng)期反復(fù)日光曝露是最常見(jiàn)的誘發(fā)因素。以往研究認(rèn)為光線性角化病的發(fā)病主要與UVB造成的基因突變及免疫抑制密切相關(guān)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)自噬在其中也起到了重要作用，結(jié)合本課題前期研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)Rab23在光線性角化病中高表達(dá)，我們推測(cè)Rab23很可能參與了光線性角化病中自噬的調(diào)節(jié)。因此，本實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)在Rab23對(duì)UVB

2、誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)其調(diào)節(jié)的機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：免疫組化檢測(cè)光線性角化病與正常皮膚組織中Rab23及自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的表達(dá)；細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)以UVB照射的HaCaT細(xì)胞為模型，運(yùn)用蛋白免疫印跡檢測(cè)Rab23及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)及Rab23調(diào)控自噬的相關(guān)信號(hào)通路ERK1/2、mTOR、AKT的表達(dá)水平及驗(yàn)證相關(guān)通路之間關(guān)系；免疫熒光共聚焦觀察UVB是否可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞

3、自噬的產(chǎn)生及Rab23與LC3是否存在共定位。
　　結(jié)果：
　　1．Rab23及自噬相關(guān)蛋白在光線性角化病中表達(dá)水平：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Rab23和自噬LC3、Beclin1在光線性角化病表皮中高表達(dá)，而在正常皮膚組織中僅在基底膜帶低表達(dá)或不表達(dá)。
　　2．UVB可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞自噬水平升高：免疫熒光及蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在劑量為30mJ/cm2UVB照射時(shí)自噬水平達(dá)到最高，之后隨著劑量的增加自噬水平逐漸降低，同

4、時(shí)蛋白免疫印跡結(jié)果顯示Rab23與自噬相關(guān)蛋白有著一致性的變化。隨后用30mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞，分別于0h、2h、6h、12h檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在2h時(shí)自噬水平最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)自噬水平逐漸下降。為了進(jìn)一步觀察 Rab23與自噬的相關(guān)性，我們利用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素及自噬抑制劑氯喹刺激HaCaT細(xì)胞后，檢測(cè)Rab23與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示二者仍有著一致性的變化，高度提示Rab23參與了U

5、VB誘導(dǎo)的自噬過(guò)程。
　　3．自噬對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞存活率的影響：CCK8檢測(cè)30mJ/cm2UVB照射后自噬促進(jìn)劑雷帕霉素及抑制劑氯喹對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示促進(jìn)自噬可使存活率提高，而抑制自噬則降低存活率。
　　4．Rab23對(duì)自噬的調(diào)控作用：蛋白免疫印跡方法檢測(cè)30mJ/cm2UVB照射后2h在穩(wěn)定表達(dá)不同水平Rab23的HaCaT細(xì)胞中的自噬水平，結(jié)果顯示Rab23過(guò)表達(dá)后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高

6、，而干涉Rab23的表達(dá)后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，同樣免疫熒光結(jié)果也顯示在Rab23過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中LC3熒光數(shù)目較對(duì)照組增多。
　　5．Rab23調(diào)控自噬的機(jī)制：免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示Rab23與自噬相關(guān)蛋白LC3并不存在共定位關(guān)系。通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)調(diào)控自噬相關(guān)通路及Rab23對(duì)這些通路的影響，結(jié)果顯示，UVB照射后ERK1/2的通路激活及mTOR通路的抑制受Rab23的調(diào)節(jié)，過(guò)表達(dá)Rab23后可促進(jìn)ERK的表達(dá)抑制mTOR