Rab23在UVB照射誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞黑素合成中的作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　生理狀態(tài)下的黑素合成有利于保護(hù)皮膚免受外界環(huán)境刺激，當(dāng)反復(fù)暴露于一種或多種刺激條件下，會(huì)引起異常的黑素合成。皮膚出現(xiàn)色素沉著最常見的誘因之一是紫外線，反復(fù)暴露于紫外線照射會(huì)引起皮膚紅斑、色素沉著、炎癥反應(yīng)等，已有研究證實(shí) UVB具有誘導(dǎo)黑素合成的特性，但其具體機(jī)制目前尚未完全闡明。研究表明UVB可引起皮膚黑素細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，樹突增多，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞旁分泌a-MSH等作用于黑素細(xì)胞促進(jìn)黑素合成。近年來在色素紊亂

2、疾病方面的基因?qū)W和生物化學(xué)的研究顯示，Rab分子介導(dǎo)的內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物的毛發(fā)和皮膚的色素沉著過程中有關(guān)鍵的作用。有學(xué)者觀察到UVB照射角質(zhì)形成細(xì)胞后可引起細(xì)胞中的Rab23表達(dá)水平顯著增高，提示Rab23參與了UVB刺激后的角質(zhì)形成細(xì)胞生理/病理活動(dòng)。因此我們推測Rab23可能參與調(diào)控了UVB誘導(dǎo)的黑素合成。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探究Rab23在UVB誘導(dǎo)黑素細(xì)胞黑素合成過程中的調(diào)控效應(yīng)。
　　方法：
　

3、　以UVB照射PIG1細(xì)胞為模型誘導(dǎo)黑素細(xì)胞黑素合成，觀察不同劑量的UVB處理不同時(shí)間后對(duì)PIG1細(xì)胞黑素合成水平的影響，使用NaOH溶解法檢測黑素細(xì)胞黑色素含量變化。蛋白免疫印跡檢測Rab23與黑素合成相關(guān)蛋白gp100的蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建Rab23沉默的PIG1細(xì)胞系，使用50mJ/cm2UVB處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)1h、6h、12h后采用蛋白免疫印跡檢測黑素合成相關(guān)蛋白gp100的表達(dá)變化，運(yùn)用NaOH溶解法檢測黑素細(xì)胞黑素含量。在R

4、ab23沉默的PIG1細(xì)胞系中使用50mJ/cm2UVB處理細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6h后，NaOH溶解法檢測黑素細(xì)胞黑素含量，Western印跡檢測MITF的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.UVB以劑量依賴方式誘導(dǎo) Rab23及黑素合成水平升高：蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，UVB照射劑量在一定范圍內(nèi)（<100mJ/cm2），不同劑量照射培養(yǎng)黑素細(xì)胞6h，隨照射劑量的增加，細(xì)胞黑色素含量增高，細(xì)胞黑素合成相關(guān)蛋白gp100表達(dá)水平增高，同

5、時(shí)Rab23的表達(dá)也呈逐步增高的變化趨勢。
　　2.UVB以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)Rab23及黑素合成水平升高：考慮100mJ/cm2 UVB照射時(shí)造成黑素細(xì)胞貼壁能力明顯減弱，懸浮細(xì)胞增多，因此選擇50mJ/cm2UVB照射黑素細(xì)胞；分別于處理后0.5h、1h、2h、6h、12h檢測Rab23以及黑素合成相關(guān)蛋白gp100表達(dá)水平，結(jié)果顯示，隨著UVB照射后作用時(shí)間的延長，細(xì)胞黑色素含量逐漸升高，黑素合成相關(guān)蛋白gp100表達(dá)水平逐漸

6、升高，Rab23也有一致的變化趨勢，高度提示Rab23參與了UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞黑素合成。
　　3.下調(diào)Rab23表達(dá)可降低UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞黑素合成水平：NaOH溶解法檢測50mJ/cm2 UVB照射Rab23表達(dá)沉默的PIG1細(xì)胞后6h細(xì)胞黑素含量的水平，結(jié)果顯示，干涉Rab23表達(dá)后，細(xì)胞黑素含量明顯降低。蛋白免疫印跡檢測50mJ/cm2 UVB照射Rab23表達(dá)沉默的PIG1細(xì)胞后6h黑素合成相關(guān)蛋白gp100的表達(dá)水平

7、，結(jié)果顯示，降低Rab23表達(dá)水平可顯著降低UVB誘導(dǎo)的黑素合成相關(guān)蛋白gp100的表達(dá)水平。
　　4.下調(diào)Rab23表達(dá)可減弱UVB照射誘導(dǎo)黑素合成相關(guān)蛋白gp100表達(dá)隨時(shí)間延長而增加的變化趨勢：蛋白免疫印跡檢測50mJ/cm2 UVB照射Rab23表達(dá)沉默的PIG1細(xì)胞后黑素合成相關(guān)蛋白gp100隨時(shí)間變化的趨勢，結(jié)果顯示，干涉Rab23表達(dá)后，UVB照射誘導(dǎo)黑素合成相關(guān)蛋白gp100表達(dá)隨時(shí)間延長而增加的變化趨勢顯著減弱，

8、證實(shí)Rab23參與了UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞黑素合成，并發(fā)揮重要作用。
　　5.UVB照射可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中MITF表達(dá)升高：蛋白免疫印跡檢測UVB照射后MITF的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，UVB照射可引起MITF蛋白表達(dá)水平升高，且隨著UVB處理后培養(yǎng)時(shí)間的延長，MITF蛋白表達(dá)水平逐漸升高。
　　6.下調(diào)Rab23表達(dá)可降低黑素細(xì)胞中MITF表達(dá)水平：使用50mJ/cm2 UVB處理黑素細(xì)胞后6h，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，干涉Rab2

9、3表達(dá)后，MITF蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示MITF參與了Rab23調(diào)控黑素細(xì)胞黑素合成的過程。
　　7.下調(diào)Rab23表達(dá)可減弱UVB照射誘導(dǎo)MITF表達(dá)隨時(shí)間延長逐漸增加的趨勢：50mJ/cm2 UVB照射Rab23沉默的PIG1細(xì)胞后1h、6h、12h，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，干涉Rab23表達(dá)后，UVB照射誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中MITF表達(dá)隨時(shí)間延長而增加的變化趨勢減弱，證實(shí)Rab23可通過調(diào)控MITF表達(dá)水平參與UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)