Wnt3a對(duì)小鼠黑素細(xì)胞譜系黑素生成的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 黑素細(xì)胞在黑素小體內(nèi)合成黑素，并將黑素顆粒傳遞給臨近的角質(zhì)形成細(xì)胞，產(chǎn)生有顏色的皮膚或毛發(fā)。皮膚中黑素細(xì)胞的主要作用是防護(hù)人的皮膚免受紫外線的損傷。最新研究表明，白癜風(fēng)白斑表皮無(wú)黑素細(xì)胞，但毛囊外根鞘隆突區(qū)(Bulge)內(nèi)黑素干細(xì)胞仍然存在，在治療恢復(fù)區(qū)皮損中，Bulge中黑素干細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并出現(xiàn)有功能的黑素細(xì)胞；而白癜風(fēng)恢復(fù)時(shí)首先表現(xiàn)為在毛囊口產(chǎn)生色素點(diǎn)，然后逐漸向外擴(kuò)大形成色素島，最后色素島相互融合，

2、白斑色素恢復(fù)正常；而掌跖及黏膜等無(wú)毛囊的部位，白癜風(fēng)很難恢復(fù)。由此可見(jiàn)，毛囊中靜止的黑素干細(xì)胞可在治療作用下重新活化、分裂增殖，由無(wú)功能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ軤顟B(tài)，成為白癜風(fēng)治療恢復(fù)時(shí)黑素細(xì)胞的來(lái)源。并且，研究發(fā)現(xiàn)，Bulge中黑素干細(xì)胞的提前分化是衰老性白發(fā)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。因此，黑素細(xì)胞的作用不僅僅是產(chǎn)生黑素顆粒，它對(duì)色素減退性皮膚病(如白癜風(fēng))的復(fù)色過(guò)程，毛干的正常維持，白發(fā)形成或逆轉(zhuǎn)都有重要意義。
　　 黑素細(xì)胞來(lái)源于神經(jīng)嵴起源的黑素

3、母細(xì)胞。在胚胎晚期，神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑素母細(xì)胞，后者通過(guò)遷移進(jìn)入表皮基底層。在哺乳動(dòng)物有毛的皮膚部位，黑素母細(xì)胞進(jìn)一步由表皮遷移進(jìn)入發(fā)育中的毛囊，并最終定居在此。在小鼠，黑素母細(xì)胞在E10.5～12.5進(jìn)入真皮，E13.5進(jìn)入表皮，E14.5開(kāi)始從表皮基底部向發(fā)育中的毛囊遷移，E15.5進(jìn)入毛芽，此后，黑素母細(xì)胞分為兩個(gè)不同的走向：一部分繼續(xù)遷移，進(jìn)入毛囊底部毛球部，分化為成熟黑素細(xì)胞(melanocytes，MCs)，表達(dá)MITF、T

4、RP1、TRP2和Tyr，負(fù)責(zé)毛發(fā)的色素沉著；另一部分遷移到毛囊上部隆突區(qū)(Bulge)并定居下來(lái)，分化為黑素干細(xì)胞(melanocyte stem cells，McSCs)，只表達(dá)DCT，不產(chǎn)生黑素，是毛發(fā)黑素細(xì)胞和黑素的來(lái)源。
　　 目前已知，正常毛發(fā)是Bulge內(nèi)兩類干細(xì)胞共同工作的結(jié)果：毛囊干細(xì)胞是新毛發(fā)生和生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，黑素干細(xì)胞則提供毛發(fā)黑素的來(lái)源。成熟毛囊中的黑素細(xì)胞譜系可分為三類不同的細(xì)胞類型：Bulge中主要處于

5、靜息狀態(tài)的黑素干細(xì)胞、分化中的TA細(xì)胞(transient amplifying cells)以及位于毛球部的終末分化的黑素細(xì)胞，前兩者為未成熟黑素細(xì)胞，最后一類則是成熟黑素細(xì)胞。研究表明，毛囊黑素細(xì)胞譜系的生物學(xué)活性與毛囊周期密切相關(guān)。在毛囊靜止期末，巢內(nèi)兩類干細(xì)胞被分別激活，并進(jìn)入初始分化進(jìn)程，毛囊從靜止期轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)早期，此時(shí)毛囊細(xì)胞干和黑素干細(xì)胞均發(fā)生快速不對(duì)稱分裂，其子代細(xì)胞中，部分返回Bulge，恢復(fù)靜息干細(xì)胞狀態(tài)，而TA細(xì)胞則

6、向毛囊遠(yuǎn)端遷移，最后進(jìn)入毛球，在此，兩類細(xì)胞分別進(jìn)一步增殖分化為上皮類細(xì)胞及黑素細(xì)胞。隨著毛囊和毛發(fā)生長(zhǎng)，黑素細(xì)胞中黑素小體出現(xiàn)并逐漸增加，隨后，黑素小體成熟并被轉(zhuǎn)運(yùn)到毛囊干細(xì)胞分化生成的接受細(xì)胞中，毛發(fā)呈現(xiàn)顏色。在生長(zhǎng)晚期，毛球下端的上皮細(xì)胞凋亡，毛囊逐漸縮短；同時(shí)黑素細(xì)胞退化，主要黑素合成酶(TYR/TRP1)活性明顯下降，黑素生成減少，部分分化的黑素細(xì)胞凋亡。在退化期和靜止期，毛囊干細(xì)胞和黑素干細(xì)胞主要處于靜息狀態(tài)，但在靜止期末，

7、它們又被重新激活并觸發(fā)下一個(gè)毛囊周期，開(kāi)始新一輪增殖、分化和遷移的單向路徑，并再次完成毛發(fā)生長(zhǎng)、黑素生成和傳遞。
　　 Wnt3a是Wnt家族的成員之一，通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑起作用。已有的研究表明，Wnt3a對(duì)黑素細(xì)胞發(fā)育有重要作用。靶向敲除Wnt1和Wnt3a基因的小鼠出生后沒(méi)有黑素細(xì)胞。體外研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)嵴細(xì)胞在無(wú)Wnt1和Wnt3a條件情況下，分化為神經(jīng)元細(xì)胞而非黑素細(xì)胞；當(dāng)用Wnt3a處理后，可誘導(dǎo)其分

8、化為黑素細(xì)胞而非神經(jīng)細(xì)胞。Wnt3a也可促進(jìn)神經(jīng)嵴來(lái)源細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞向黑素母細(xì)胞分化，并進(jìn)一步分化為黑素細(xì)胞。
　　 雖然目前對(duì)Wnt3a在黑素細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的重要作用已有一定了解，但Wnt3a對(duì)生后的黑素細(xì)胞譜系是否也有重要作用仍不清楚。
　　 研究目的：
　　 本課題擬研究Wnt3a在生后小鼠毛囊周期中的時(shí)空表達(dá)情況，以及Wnt3a在黑素細(xì)胞譜系中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討體內(nèi)、體外情況下過(guò)表達(dá)Wnt3a對(duì)黑素

9、細(xì)胞譜系(成熟黑素細(xì)胞、未成熟黑素細(xì)胞--黑素干細(xì)胞和TA細(xì)胞)黑素合成的影響，并探索可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.Wnt3a在小鼠黑素細(xì)胞譜系中的表達(dá)研究
　　 (1)本課題以Dct-LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，通過(guò)X-gal染色技術(shù)觀察小鼠黑素細(xì)胞譜系在生后小鼠皮膚中的分布情況，并采用RT-PCR和Western blot方法對(duì)小鼠各周期中皮膚全層Wnt3a的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析；

10、>　　 (2)采用X-gal染色結(jié)合免疫熒光技術(shù)，免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，觀察Wnt3a在小鼠黑素細(xì)胞譜系中的表達(dá)情況。
　　 (3)運(yùn)用X-gal染色結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑在生長(zhǎng)期毛囊黑素細(xì)胞譜系中是否存在。
　　 2.Wnt3a對(duì)小鼠黑素細(xì)胞譜系黑素生成的體外研究
　　 (1)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增AdWnt3a，AdGFP和AdSimMITF，并通過(guò)氯化銫梯度離

11、心純化病毒。
　　 (2)選取melan-a黑素細(xì)胞為成熟黑素細(xì)胞模型，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot方法檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)下Wnt3a在細(xì)胞中的表達(dá)情況；TOP/FOP-flash雙熒光素酶報(bào)告基因方法分析AdWnt3a感染后細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)的激活情況；MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU以及流式檢測(cè)細(xì)胞周期方法檢測(cè)Wnt3a對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響；黑素含量測(cè)定、酪氨酸酶活性分析、RT-PCR以及Western

12、 blot方法檢測(cè)Wnt3a對(duì)黑色合成的影響；并通過(guò)AdSimMITF阻斷內(nèi)源性MITF，分析Wnt3a對(duì)黑素細(xì)胞作用的可能機(jī)制。
　　 (3)選取iMC23黑素細(xì)胞前體細(xì)胞為未成熟黑素細(xì)胞模型，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、酪氨酸酶活性分析、Western blot方法檢測(cè)Wnt3a對(duì)未成熟黑素細(xì)胞分化以及黑素合成的影響。
　　 (4)培養(yǎng)小鼠皮膚原代黑素細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察分析Wnt3a對(duì)原代黑素細(xì)胞的影響。
　　 3.W

13、nt3a對(duì)小鼠黑素細(xì)胞譜系黑素生成的體內(nèi)研究
　　 (1)通過(guò)小鼠靜止期皮膚在體注射腺病毒模型，皮內(nèi)注射AdWnt3a，觀察皮膚表型及組織學(xué)觀察。
　　 (2)通過(guò)小鼠拔毛誘導(dǎo)同步化模型，皮內(nèi)注射AdSimMITF、聯(lián)合注射AdSimMITF+AdWnt3，觀察表型改變及組織學(xué)觀察。
　　 結(jié)果與討論：
　　 1.Wnt3a在小鼠黑素細(xì)胞譜系中的表達(dá)研究
　　 (1)在生長(zhǎng)期，Wnt3a蛋白的分布

14、較為廣泛，在表皮、外根鞘、內(nèi)根鞘以及毛球部均有表達(dá)；在退化期，Wnt3a蛋白僅在外根鞘有表達(dá)；在靜止期，幾乎檢測(cè)不到Wnt3a蛋白的表達(dá)。Wnt3a mRNA相對(duì)表達(dá)情況與免疫組化結(jié)果一致，在生長(zhǎng)期達(dá)到峰值，退化期減弱，靜止期最弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Wnt3a在毛囊周期中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，提示W(wǎng)nt3a可能對(duì)毛囊生長(zhǎng)、毛囊中多種組織/細(xì)胞的生物學(xué)活性起到一定的作用。
　　 (2)在生長(zhǎng)期毛囊中，毛囊外根鞘的黑素干細(xì)胞/TA細(xì)胞、毛球部

15、的黑素細(xì)胞均有Wnt3a蛋白表達(dá)。在退化期毛囊中，毛囊中黑素細(xì)胞凋亡，雖然Wnt3a在外根鞘有微弱表達(dá)，但在黑素干細(xì)胞中未觀察到Wnt3a蛋白。在靜止期，無(wú)黑素細(xì)胞存在，黑素干細(xì)胞不表達(dá)Wnt3a蛋白。當(dāng)毛囊進(jìn)入下一個(gè)生長(zhǎng)期時(shí)，Wnt3a蛋白再次表達(dá)于黑素細(xì)胞譜系。Wnt3a蛋白在黑素細(xì)胞譜系中的周期性表達(dá)，提示W(wǎng)nt3a可能對(duì)調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞譜系的生物學(xué)活性相關(guān)。
　　 (3)在生長(zhǎng)期毛囊黑素細(xì)胞中，β-catenin和Lef-1

16、均呈細(xì)胞核表達(dá)，黑素干細(xì)胞中未檢測(cè)到β-catenin細(xì)胞核表達(dá)與Lef-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明生長(zhǎng)期黑素細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)途徑處于活化狀態(tài)，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)途徑可能對(duì)黑素細(xì)胞的增殖、分化或黑素合成起到一定作用。
　　 2.Wnt3a對(duì)小鼠黑素細(xì)胞譜系黑素生成的體外研究
　　 (1)通過(guò)HEK293成功擴(kuò)增了高滴度的AdWnt3a、AdGFP和AdSimMITF。
　　 (2)

17、Wnt3a對(duì)小鼠成熟黑素細(xì)胞(melan-a細(xì)胞)的體外研究結(jié)果：AdWnt3a可有效感染黑素細(xì)胞，成功表達(dá)Wnt3a蛋白，并且能夠激活細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑；Wnt3a對(duì)黑素細(xì)胞的增殖具有抑制作用，同時(shí)伴隨著S期細(xì)胞減少、G1期細(xì)胞增加現(xiàn)象；Wnt3a可通過(guò)上調(diào)MITF以及下游靶基因TYR和TRP1的表達(dá)，從而促進(jìn)黑素合成。
　　 (3)Wnt3a對(duì)小鼠未成熟黑素細(xì)胞(iMC23細(xì)胞)的體外研究結(jié)果：Wnt3

18、a可促進(jìn)未成熟黑素細(xì)胞前體細(xì)胞分化并產(chǎn)生黑素，在此過(guò)程中MITF可作為Wnt3a下游分子參與分化過(guò)程。
　　 (4)Wnt3a對(duì)小鼠原代黑素細(xì)胞的體外研究結(jié)果：Wnt3a可促進(jìn)原代黑素細(xì)胞分化并產(chǎn)生黑素。
　　 3.Wnt3a對(duì)小鼠黑素細(xì)胞譜系黑素生成的體內(nèi)研究
　　 (1)小鼠靜止期皮膚在體注射模型結(jié)果：Wnt3a可促進(jìn)毛囊干細(xì)胞激活，同時(shí)也促進(jìn)黑素干細(xì)胞激活，分化生成黑素細(xì)胞并產(chǎn)生黑素。
　　 (2)

19、小鼠拔毛誘導(dǎo)同步化注射模型結(jié)果：阻斷體內(nèi)毛囊黑素細(xì)胞中MITF，可抑制黑素合成，但在Wnt3a存在的情況下，Wnt3a可挽回SimMITF對(duì)黑素合成的抑制作用，說(shuō)明MITF是Wnt3a的直接靶基因。
　　 結(jié)論：
　　 本課題首次證明了Wnt3a在小鼠毛囊周期中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式以及在黑素細(xì)胞譜系表達(dá)情況，并且從體外和體內(nèi)兩個(gè)方面證明了Wnt3a具有促進(jìn)未成熟黑素細(xì)胞分化以及黑素合成、促進(jìn)成熟黑素細(xì)胞黑素合成的作用。本課題著