UVB誘導(dǎo)細(xì)胞損傷機(jī)制及紅景天苷保護(hù)作用的初步研究.pdf

1、背景：
　　 近年皮膚癌，特別是鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率明顯上升，并呈年輕化趨勢(shì)，據(jù)報(bào)道90％的皮膚癌與紫外線照射損傷有關(guān)。過量的紫外線照射可導(dǎo)致皮膚灼傷、曬黑及免疫抑制，長期作用還可以引起皮膚光老化，并誘發(fā)皮膚癌。
　　 紫外線輻射按波長不同分為UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)和UVC(100～280nm)。太陽輻射通過大氣層時(shí)所有的UVC和大約90％的UVB能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收，UVA

2、則較少受到大氣的影響，因此，到達(dá)地面的紫外線主要是UVA和少量UVB。但是UVB的生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)度是UVA的1000～10000倍，是引起皮膚光老化的主要誘發(fā)因素。同時(shí)，地球上方的臭氧層對(duì)紫外線的吸收作用急劇下降的區(qū)域，為310nm～315nm的范圍內(nèi)，即UVB的波長范圍。近年來由于地球上方臭氧空洞的形成及增大，致使大氣層對(duì)UVB的吸收減弱，并進(jìn)一步導(dǎo)致到達(dá)地球表面的UVB的量迅速增加，因此UVB對(duì)生物體損傷的機(jī)制及其防護(hù)的研究具有理論和

3、實(shí)際意義。當(dāng)UVB引起的損傷發(fā)生于原癌和或抑癌基因時(shí)，將可能導(dǎo)致表皮細(xì)胞異常增生，甚至發(fā)生癌變。但目前臨床治療皮膚癌的方法有限，尋找一種新的有效的防治皮膚癌的天然藥物就成為當(dāng)前亟待解決的課題之一。
　　 紅景天具有提高機(jī)體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)、改善人體造血機(jī)能、抗缺氧、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗病毒、抗輻射、預(yù)防高原反應(yīng)等多種功能。有研究發(fā)現(xiàn)UV照射后，紅景天能夠增強(qiáng)皮膚角質(zhì)化細(xì)胞的抗氧化能力，具有一定的修復(fù)和光保護(hù)作用。<

4、br>　　 UVB誘導(dǎo)的皮膚腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的連續(xù)過程，包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遺傳改變，其中，UVB誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因p53的突變被認(rèn)為是一個(gè)早期步驟。p53基因在體內(nèi)充當(dāng)“基因衛(wèi)士”的角色，可以依靠對(duì)其下游因子的激活或抑制來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與凋亡，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期組滯、DNA修復(fù)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，從而避免受損的DNA堆積、維持基因組的穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老，在細(xì)胞周期中具有重要的調(diào)節(jié)作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，

5、14-3-3σ位于p53的下游，受p53表達(dá)的調(diào)節(jié)，并在細(xì)胞的突變、細(xì)胞周期阻滯中發(fā)揮了重要作用。各種損傷因子引起的DNA損傷可激活p53去磷酸化，并結(jié)合在14-3-3σ轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.8kb處的啟動(dòng)子，隨后激活和升高14-3-3σ的表達(dá)，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入分裂期，以便進(jìn)行DNA修復(fù)。另外，14-3-3σ也可以反饋調(diào)節(jié)p53的表達(dá)，穩(wěn)定并且提高p53的轉(zhuǎn)錄活性，因此，在p53和14-3-3σ可能存在一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)以維持其功能。在癌組

6、織中，突變的p53導(dǎo)致14-3-3σ表達(dá)降低，因此14-3-3σ不能形成G2阻滯，使得突變發(fā)生和染色體結(jié)構(gòu)異常。
　　 目的：
　　 目前為止，關(guān)于紅景天抗輻射、抗腫瘤作用的研究相對(duì)來說還是很少，而且對(duì)人體皮膚腫瘤的作用尚未見報(bào)道。本文以人體表皮正常細(xì)胞即HaCaT細(xì)胞、14-3-3σ高表達(dá)的HaCaT細(xì)胞及低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞即A431細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞在UVB照射后存

7、活率的差異，及紅景天苷對(duì)UVB誘導(dǎo)的人體表皮正常細(xì)胞即HaCaT細(xì)胞、14-3-3σ高表達(dá)的HaCaT細(xì)胞及其低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞即A431細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行了初步探討。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞分別用含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng);14-3-3σ高表達(dá)、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞分別用含10％小牛血清

8、、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100μg/mlG418的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO2、37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2、紫外光光源上海顧村光電儀器廠生產(chǎn)，并經(jīng)上海市計(jì)量局檢測(cè)，其發(fā)射的紫外線波峰為305nm，當(dāng)光源距樣品垂直距離為40cm時(shí)的功率密度為16.5μW/cm2。
　　 3、HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞在不同劑量UVB作用后的存活率取對(duì)數(shù)期生長的HaCaT細(xì)胞和A431

9、細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，HaCaT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為8～10×104/ml，A431細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)液，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細(xì)胞后在距UVB光源40cm處用不同劑量(0、5、10、15、20、25J/m2)的UVB分別照射兩種細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)20h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　 4、HaCaT細(xì)胞和A43

10、1細(xì)胞在加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對(duì)數(shù)期生長的HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，HaCaT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為8～10×104/ml，A431細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　 5、25

11、J/m2的UVB照射HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞后再加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對(duì)數(shù)期生長的HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，HaCaT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為8～10×104/ml，A431細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細(xì)胞后在距UVB光源40cm處用25J/m2的UVB分別照射兩種細(xì)胞，同

12、時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，并于照射后分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，兩種細(xì)胞均以未受照組作為對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　 6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布在UVB照射前及照后12h、18h、24h收集HaCaT細(xì)胞并計(jì)數(shù)使細(xì)胞數(shù)大于1×106個(gè)，1000rpm離心3 min后用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次。加入預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過夜。固定好的細(xì)胞1000rpm離心3min，

13、1 ml預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，500μlPBS重懸細(xì)胞并分別加入PI和RNases A，37℃避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 7、Western blot檢測(cè)細(xì)胞p53，14-3-3σ蛋白表達(dá)的變化在UVB照前、照后1h、2h、4h、8h、12h收集HaCaT細(xì)胞，用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，提取的細(xì)胞總蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（10％分離膠和4％濃縮膠），轉(zhuǎn)膜、5％脫脂奶粉封閉、一抗室溫孵

14、育2h、TBST漂洗、二抗室溫孵育2h、TBST漂洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后進(jìn)行顯影、定影。
　　 8、用PT-PCR和Western blot法，分別從RNA水平和蛋白水平檢測(cè)不同種類細(xì)胞14-3-3σ表達(dá)效果。
　　 9、30J/m2的UVB分別照射HaCaT細(xì)胞、14-3-3σ高表達(dá)的HaCaT細(xì)胞及其低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞后再加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對(duì)數(shù)期生長的HaCaT細(xì)胞、14-3-3σ高

15、表達(dá)和低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞及A431細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，14-3-3σ高表達(dá)和正常的HaCaT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為8～10×104/ml，14-3-3σ低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1.2～1.3×105個(gè)/ml，A431細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細(xì)胞后在距UVB光源40cm處用30J/m2的

16、UVB分別照射兩種細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，并于照射后分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，四種細(xì)胞均以未受照組作為對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件，同種細(xì)胞各組間細(xì)胞存活率采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)

17、分析，行雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同劑量的UVB照射HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞后細(xì)胞的存活率均呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，HaCaT細(xì)胞的存活率的改變從UVB照射15J/m2時(shí)有顯著差異(P＜0.05); A431細(xì)胞的存活率的改變從UVB照射5J/m2時(shí)有顯著差異(P＜0.05)，說明UVB對(duì)細(xì)胞有殺傷作用。
　　 2、不同劑量的紅景天苷孵育20h后HaCaT細(xì)胞的存活率呈先

18、上升后下降的趨勢(shì)，但無顯著差異(P＞0.05);而A431細(xì)胞的存活率則呈逐漸下降的趨勢(shì)，且從紅景天苷的劑量為40μg/ml時(shí)差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷對(duì)正常皮膚細(xì)胞可能有保護(hù)作用而對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。
　　 3、25J/m2照射后，加入不同劑量的紅景天苷使HaCaT細(xì)胞的存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在紅景天苷的劑量為10、60和80μg/ml時(shí)差異顯著(P＜0.05);而A431細(xì)胞的存活率呈逐漸下降的趨勢(shì)，且從

19、紅景天苷的劑量為40μg/ml時(shí)差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷對(duì)正常皮膚細(xì)胞在低劑量時(shí)有保護(hù)作用、高劑量時(shí)有殺傷作用，而對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。
　　 4、HaCaT細(xì)胞在接受30mJ/cm2的UVB照射后，在照后18h發(fā)生了較明顯的G2/M期阻滯。
　　 5、UVB照射后，HaCaT細(xì)胞的p53蛋白，磷酸化的p53蛋白的表達(dá)量在照后1h出現(xiàn)升高，于照后12h，磷酸化的p53表達(dá)水平開始下降，但仍高于對(duì)照組;14-3

20、-3σ蛋白在照后1h也逐漸升高，至12h仍未見下降。
　　 6、14-3-3σ蛋白過表達(dá)的細(xì)胞株和HaCat細(xì)胞株相比，14-3-3σ的表達(dá)明顯升高，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株和HaCaT細(xì)胞株相比，14-3-3σ的表達(dá)明顯降低。
　　 7、不同種類的細(xì)胞在UVB照射后單獨(dú)UVB處理組細(xì)胞的存活率明顯低于未處理組，且差異顯著(P＜0.05)，說明UVB對(duì)細(xì)胞有殺傷作用。但是14-3-3σ高表達(dá)、低表達(dá)和正常的HaCaT細(xì)胞在UVB照射

21、后單獨(dú)UVB處理組細(xì)胞的存活率存在明顯差異，說明14-3-3σ蛋白在UVB輻射中發(fā)揮了作用。在UVB處理后，HaCaT14-3-3σ-/-和A431細(xì)胞隨著紅景天苷劑量的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，且從紅景天苷劑量為20μg/ml時(shí)與UVB處理組相比差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷聯(lián)合UVB對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用;而HaCaT14-3-3σ+/+和正常的HaCaT細(xì)胞隨著紅景天苷劑量的增加，細(xì)胞存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)，HaCaT1

22、4-3-3σ+/+細(xì)胞在紅景天苷劑量為40μg/ml時(shí)與UVB處理組相比差異顯著(P＜0.05)，而HaCaT細(xì)胞隨紅景天苷劑量的增加細(xì)胞存活率的增加無顯著差異(P＞0.05)，說明紅景天苷對(duì)HaCaT細(xì)胞可能有保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、不同劑量的UVB照射HaCaT細(xì)胞和A431細(xì)胞后細(xì)胞的存活率均呈下降趨勢(shì)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)照射劑量的選擇提供了依據(jù)。UVB誘導(dǎo)后紅景天苷對(duì)正常皮膚細(xì)胞在低劑量時(shí)有保護(hù)作用、高劑量時(shí)

23、有殺傷作用而對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。
　　 2、14-3-3σ蛋白表達(dá)量不同的細(xì)胞在UVB照射后細(xì)胞的存活率存在明顯差異，說明14-3-3σ蛋白在UVB輻射損傷中發(fā)揮了作用。而且14-3-3σ蛋白不同表達(dá)的細(xì)胞在UVB照射后，紅景天苷對(duì)其保護(hù)作用與14-3-3σ蛋白的表達(dá)量有關(guān)，說明UVB照射后紅景天苷經(jīng)由14-3-3σ蛋白發(fā)揮了作用。紅景天苷聯(lián)合UVB對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)正常皮膚細(xì)胞的可能保護(hù)作用，使之可能成為新的防輻射藥物。<