缺氧誘導(dǎo)大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及紅景天苷干預(yù)作用.pdf

1、背景:陰莖勃起功能障礙是臨床上一種常見(jiàn)疾病，一線藥5-型磷酸二酯酶抑制劑仍有35％患者治療無(wú)效。海綿體平滑肌細(xì)胞是調(diào)節(jié)陰莖勃起及維持勃起的重要功能單位。各種誘發(fā)因素如糖尿病、高血壓、高血脂、前列腺癌根治術(shù)和心血管系統(tǒng)疾病等導(dǎo)致陰莖海綿體缺氧和平滑肌細(xì)胞減少等是ED并發(fā)癥主要的病理生理學(xué)共性。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)平滑肌與多組織器官纖維化密切相關(guān)，在缺氧等多種因素刺激下，通過(guò)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化參與組織重構(gòu)。而海綿體平滑肌是否參與陰莖海綿體纖維化尚未

2、報(bào)道。紅景天苷具有抗缺氧作用，這在國(guó)內(nèi)外均有大量報(bào)道。
　　目的:研究體內(nèi)外缺氧對(duì)SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞(CCSMC)表型轉(zhuǎn)化及紅景天苷的干預(yù)作用。
　　方法:1.體外部分:采用組織貼壁法和酶消化法體外分離培養(yǎng)SD大鼠海綿體平滑肌原代細(xì)胞;應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光、透射電鏡方法鑒定SD大鼠CCSMC;采用缺氧小室建立細(xì)胞缺氧模型，并通過(guò)光鏡、透射電鏡檢測(cè)缺氧前后CCSMC形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化;采用MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CCSMC

3、缺氧前后細(xì)胞活力、周期及凋亡情況;采用免疫組化、Western blotting和定量PCR等技術(shù)檢測(cè)CCSMC缺氧前后缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、細(xì)胞表型相關(guān)標(biāo)志物蛋白和基因(α-SMA、Vimentin、CNN1等)水平及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Myocd、Elk-1及KLF等）水平;并進(jìn)一步運(yùn)用腺病毒技術(shù)沉默和過(guò)表達(dá)CCSMC的HIF-1α基因，驗(yàn)證缺氧介導(dǎo)CCSMC表型轉(zhuǎn)化。
　　2.體內(nèi)部分:采用切除SD大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)方法

4、建立大鼠ED缺氧模型，12周后采用多功能生物信息采集器檢測(cè)ICP;取陰莖組織固定。采用透射電鏡、HE染色等方法觀察陰莖海綿體結(jié)構(gòu)、形態(tài)的改變。采用MASSON染色評(píng)估海綿體組織纖維化程度及采用免疫組化、Western Blotting等方法檢測(cè)陰莖海綿體組織HIF-1α表達(dá)水平及平滑肌表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志蛋白α-SMA、Vimentin等表達(dá)水平。
　　3.紅景天苷干預(yù)作用觀察:
　　1)細(xì)胞部分:采用紅景天苷低劑量(3ug/m

5、L)與高劑量(30ug/mL)預(yù)處理細(xì)胞，再進(jìn)行缺氧48小時(shí)。采用光鏡、透射電鏡觀察缺氧前后CCSMC形態(tài)及結(jié)構(gòu);采用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)紅景天苷對(duì)缺氧CCSMC模型的細(xì)胞活性及凋亡情況的影響;采用Western Blotting檢測(cè)紅景天苷對(duì)缺氧導(dǎo)致CCSMC表型轉(zhuǎn)化情況的影響，包括缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)和膠原(CollagenⅢ)合成、細(xì)胞表型標(biāo)志蛋白（α-SMA、Desmin、Vimentin等）表達(dá)量的改變。

6、　　2)動(dòng)物部分:SD大鼠雙側(cè)海綿體切除模型同上，分為假手術(shù)組、模型組和紅景天苷組。給藥組給予紅景天苷6mg&g，灌胃，一天一次，共12周，假手術(shù)組和模型組給予等量的水灌胃處理。12周后，ICP檢測(cè)及海綿體組織缺氧、纖維化及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)同上。
　　結(jié)果:1.原代分離培養(yǎng)的CCSMC呈現(xiàn)梭形，α-SMA、desmin表達(dá)具有較高的陽(yáng)性率，電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量肌絲;缺氧后出現(xiàn)CCSMC形態(tài)肥大，細(xì)胞內(nèi)肌絲減少、粗

7、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多等變化。CCSMC缺氧后，在HIF-1α表達(dá)增高，TGF-β和膠原(collagen)合成增多;平滑肌細(xì)胞表型調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Myocd和Elk-1和KLF-4分別上調(diào)和下調(diào);同時(shí)，CCSMC收縮型標(biāo)志蛋白表達(dá)水平明顯下降，而CCSMC合成型標(biāo)志蛋白表達(dá)水平明顯增高。HIF-1α沉默或過(guò)表達(dá)能分別逆轉(zhuǎn)或促進(jìn)CCSMC表型轉(zhuǎn)化過(guò)程。
　　2.SD大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)切除后，勃起功能減退;平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大、腫脹變形，細(xì)胞核亦腫

8、大變圓，肌絲減少或消失，細(xì)胞器腫脹、空泡化明顯等征象。海綿體膠原分泌增多、平滑肌相對(duì)含量下降，發(fā)生纖維化;海綿體組織發(fā)生HIF-1α表達(dá)增高，海綿體組織平滑肌細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)下降，Vimentin表達(dá)增加等變化。
　　3.紅景天苷能抑制體外缺氧誘導(dǎo)的CCSMC細(xì)胞凋亡，及CCSMC收縮型蛋白的表達(dá)下降和合成型蛋白的表達(dá)增高等改變;體內(nèi)檢測(cè)結(jié)果顯示紅景天苷能有效降低陰莖海綿體組織缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)和纖維化程度;此外，

9、紅景天苷還能有效升高海綿體平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)志蛋白的表達(dá)和降低合成型標(biāo)志蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了體外分離培養(yǎng)SD大鼠陰莖海綿體平滑肌原代細(xì)胞方法;
　　2.成功建立體外CCSMC缺氧模型;
　　3.體外缺氧導(dǎo)致CCSMC表型轉(zhuǎn)化，HIF-1α參與CCSMC表型轉(zhuǎn)化調(diào)控;
　　4.成功建立了SD大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)切除ED缺氧模型;
　　5.SD大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)切除ED缺氧模型導(dǎo)致陰莖