O-GlcNAc糖基化對膀胱癌細(xì)胞自噬作用的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　O-GlcNAc糖基化是一種動態(tài)的蛋白質(zhì)修飾過程，其廣泛參與細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動，越來越多的證據(jù)表明O-GlcNAc糖基化的異常修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而O-GlcNAc糖基化在膀胱癌中的作用與機(jī)制，尚未見報道。自噬是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過程，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中也發(fā)揮著重要作用。自噬作為細(xì)胞的一種重要的生理活動，受營

2、養(yǎng)狀態(tài)（包括O-GlcNAc糖基化）等多個應(yīng)激因素調(diào)節(jié)，因此我們推測O-GlcNAc糖基化通過調(diào)節(jié)自噬而在膀胱癌中發(fā)揮作用。本實驗旨在研究膀胱癌中O-GlcNAc糖基化對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，以及O-GlcNAc糖基化調(diào)節(jié)自噬的具體分子機(jī)制，并闡明O-GlcNAc糖基化修飾對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而為膀胱癌的基礎(chǔ)研究提供新的視點(diǎn)，也為臨床治療膀胱癌提供新的思路。
　　研究方法:
　　1、選取人膀胱癌細(xì)胞株5637、RT

3、4，分別使用O-GlcNAc糖基化抑制劑、O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)劑及PBS處理細(xì)胞，檢測細(xì)胞自噬的變化。檢測指標(biāo)包括熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量，Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　2、構(gòu)建并篩選出5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株，RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和R

4、T4-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株，5637-GFP-LC3/CTRL、5637-GFP-LC3/OGA-OE和5637-GFP-LC3/OGT-OE細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量，Western blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　3、利用上述細(xì)胞株，使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)胞O-GlcNAc糖基化，Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，初步選出O-GlcNAc糖基化的靶蛋白。構(gòu)建目的基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，

5、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　4、利用上述細(xì)胞株，通過免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)和Westernblot實驗，檢測O-GlcNAc糖基化直接作用的靶蛋白。
　　5、使用基因敲除和基因過表達(dá)的方法調(diào)節(jié)目的基因，Western blot檢測O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　6、體外實驗:調(diào)節(jié)5637、RT4細(xì)胞O-GlcNAc糖基化，檢測細(xì)

6、胞生物學(xué)活性的變化，包括:MTT和平板克隆形成能力檢測細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;劃痕實驗和Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。
　　7、體內(nèi)實驗:將5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株，RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA細(xì)胞株分別皮下接種裸鼠

7、，觀察裸鼠及腫瘤生長情況，免疫組化檢測腫瘤中糖基化、自噬等相關(guān)基因表達(dá)，同時關(guān)注肝、肺等轉(zhuǎn)移情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、使用O-GlcNAc糖基化抑制劑處理膀胱癌細(xì)胞5637、RT4后，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬增加，Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之，使用O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)劑處理膀胱癌細(xì)胞5637、RT4后，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬減少，Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。

8、>　　2、使用基因修飾的方法抑制細(xì)胞O-GlcNAc糖基化，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬增加，Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之，使用基因修飾的方法增強(qiáng)細(xì)胞O-GlcNAc糖基化，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞自噬減少，Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。
　　3、將自噬相關(guān)基因ULK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞株，Western blot檢測到ULK1尤其是p-ULK1(S555)在細(xì)胞自噬中起重要作用。使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)

9、胞O-GlcNAc糖基化，Western blot檢測到p-ULK1(S555)的變化。
　　4、使用不同方法調(diào)節(jié)細(xì)胞O-GlcNAc糖基化，Western blot檢測發(fā)現(xiàn):O-GlcNAc糖基化降低后，AMPK活性增加，ULK1活性增加，細(xì)胞自噬增強(qiáng);反之，O-GlcNAc糖基化增加后，AMPK活性降低，ULK1活性降低，細(xì)胞自噬減弱。Co-IP實驗顯示:O-GlcNAc糖基化直接對AMPK修飾而發(fā)揮作用。
　　5、成功

10、構(gòu)建AMPK缺失和過表達(dá)的細(xì)胞株，Western blot檢測到:p-ULK1(S555)的表達(dá)受AMPK調(diào)控，在AMPK缺如的情況下O-GlcNAc糖基化變化未引起p-ULK1(S555)的改變。
　　6、MTT和平板克隆形成實驗示:低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞增殖活力降低，高O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn):低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞G1期增加，G2/M期減少;高O-GlcNAc糖

11、基化導(dǎo)致細(xì)胞G1期減少，G2/M期增加。細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室檢測示:低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，高O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。
　　7、裸鼠皮下成瘤實驗示:與對照相比，低O-GlcNAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量下降，高O-GlcNAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量增加;低O-GlcNAc糖基化組中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移下降，高O-GlcNAc糖基化組中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移增加。另外，

12、免疫熒光證實低O-GlcNAc糖基化組中自噬增加，高O-GlcNAc糖基化組中自噬減少。
　　研究結(jié)論:
　　1、膀胱癌細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化降低后，細(xì)胞自噬流增加;反之，O-GlcNAc糖基化增加后，細(xì)胞自噬流減少。即膀胱癌細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化反向調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。
　　2、自噬相關(guān)基因ULK1在自噬過程中起重要作用。膀胱癌細(xì)胞中O-GlcNAc糖基化降低后，AMPK活性增加，ULK1活性增加，細(xì)胞自噬增強(qiáng)

13、;反之，O-GlcNAc糖基化增加后，AMPK活性降低，ULK1活性降低，細(xì)胞自噬減弱。即O-GlcNAc糖基化通過AMPK途徑調(diào)節(jié)ULK1活性，而對細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響。
　　3、體外和體內(nèi)實驗證實O-GlcNAc糖基化對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生明顯的影響:低O-GlcNAc糖基化抑制膀胱癌細(xì)胞增殖活力，高O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)細(xì)胞增殖活力;低O-GlcNAc糖基化抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力，高O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)細(xì)胞侵