己糖激酶(HK2)的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)鑒定以及HK2敲除細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪的三大代謝是哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得能量的主要方式。其中正常組織主要是依靠葡萄糖通過(guò)糖酵解途徑提供能量，糖酵解途徑中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)代謝和脂肪代謝的相關(guān)途徑提供原材料，使得三大代謝途徑能夠緊密地聯(lián)系起來(lái)。糖酵解途徑一共有十個(gè)反應(yīng)，其中存在三個(gè)關(guān)鍵調(diào)控步驟，己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是調(diào)控步驟中的三個(gè)關(guān)鍵酶。在氧氣充足的情況下葡萄糖有氧氧化產(chǎn)生的丙酮酸經(jīng)過(guò)氧化脫羧形成乙酰輔酶A將最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)提供能量

2、。在缺氧的條件下，丙酮酸通過(guò)糖酵解途徑最終被氧化為乳酸，這就是正常組織的無(wú)氧糖酵解途徑。而上世紀(jì)20年代德國(guó)生物學(xué)家Otto Warburg發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在有氧條件下會(huì)利用葡萄糖進(jìn)行糖酵解反應(yīng)并產(chǎn)生大量的乳酸作為主要的代謝途徑，該有氧糖酵解現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。
　　己糖激酶(Hexokinase，HK)是糖酵解途徑中的首個(gè)限速關(guān)鍵酶。在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)，己糖激酶存在有四種亞型（HK1，HK2，HK3和HK4），而在腫瘤細(xì)胞中

3、主要為己糖激酶2型(HK2)蛋白并且過(guò)度表達(dá)。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾在細(xì)胞生命活動(dòng)中扮演著重要的調(diào)控作用。O-GlcNAc糖基化的修飾異常能夠?qū)е履[瘤、糖尿病、心臟病與阿爾茨海默病等多種神經(jīng)退行性病變疾病的發(fā)生。本課題的研究目的就是鑒定HK2是否是O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)以及確定其糖基化位點(diǎn)，并且構(gòu)建內(nèi)源性HK2基因敲除的細(xì)胞株，為研究HK2的O-GlcNAc糖基化在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能作用奠定基礎(chǔ)。
　　本課題

4、首先通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)HK2是O-GlcNAc糖基化的蛋白質(zhì)，然后通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定HK2糖基化的位點(diǎn)。質(zhì)譜分析的HK2糖基化的樣本來(lái)自于體外標(biāo)記，其具體方法如下:通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，利用大腸桿菌表達(dá)HK2以及OGT蛋白，經(jīng)過(guò)親和層析純化獲得HK2和OGT蛋白，在體外對(duì)HK2蛋白進(jìn)行O-GlcNAc糖基化標(biāo)記，運(yùn)用質(zhì)譜分析的方法對(duì)HK2的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果檢測(cè)到5個(gè)O-GlcNAc糖基化信號(hào)，這5個(gè)糖基化位

5、點(diǎn)分別是S32、T331、T336、S340和T762。由于O-GlcNAc是單糖修飾并且易水解的特點(diǎn)，其糖基化位點(diǎn)的鑒定方法有待完善提高，本課題質(zhì)譜分析獲得的5個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)可能存在假陽(yáng)性，需要使用其它方法確認(rèn)在細(xì)胞內(nèi)HK2的O-GlcNAc糖基化的真實(shí)位點(diǎn)，為此，我們分別構(gòu)建了HK2O-GlcNAc糖基化修飾位點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體，這5個(gè)HK2突變的表達(dá)載體分別為p3×FLAG-CMV-10/HK2/S32A、 p3×FLAG-C

6、MV-10/HK2/T331A、p3×FLAG-CMV-10/HK2/T336A、 p3×FLAG-CMV-10/HK2/S340A以及p3×FLAG-CMV-10/HK2/T762A，用脂質(zhì)體Lipo fectamin2000將這樣的系列載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀進(jìn)一步確定在細(xì)胞內(nèi)HK2的O-GlcNAc糖基化修飾的真正位點(diǎn)，目前實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行之中。
　　為了研究HK2糖基化位點(diǎn)的功能，需要獲得內(nèi)源性HK2基因敲除的穩(wěn)

7、定細(xì)胞株。近幾年，隨著生物學(xué)的相關(guān)研究技術(shù)的發(fā)展，一種能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定點(diǎn)編輯改造的基因修飾技術(shù)--CRISPR/Cas9技術(shù)(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats/Cas9)為基因組的修飾提供了一種新的思路。CRISPR/Cas9技術(shù)是相比于鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger nucleases，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcrip

8、tion activatorl ike effector nuclease，Talens)技術(shù)更具有優(yōu)勢(shì)、操作更簡(jiǎn)便更靈敏的第三代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)內(nèi)源性HK2基因進(jìn)行敲除，首先試驗(yàn)設(shè)計(jì)了HK2-A、HK2-B和HK2-C共3組特異靶向HK2基因的靶位點(diǎn)，通過(guò)酶切連接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架載體中并對(duì)其測(cè)序驗(yàn)證，將構(gòu)建的載體lentiC RISPRv2/HK2-A、lentiC RI

9、SPRv2/HK2-B和lentiC RISP Rv2/HK2-C分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，提取基因組DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，通過(guò)T7E1酶切實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲除的效率。結(jié)果表明靶向序列HK2-C具有較高的突變效率，然后使用含有靶向序列HK2-C的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，運(yùn)用有限稀釋和加藥篩選的方法獲得HK2基因敲除的穩(wěn)定MDA-MB-231細(xì)胞株，采用western blotting檢測(cè)方式對(duì)敲除效果進(jìn)行了鑒定，確認(rèn)獲得了2株HK2基因敲除的單克隆