基于溫度敏感型材料的O-GlcNAc糖基化蛋白富集新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾過(guò)程，廣泛存在于生物組織、細(xì)胞內(nèi)，并且具有與蛋白質(zhì)的磷酸化修飾相似的性質(zhì)及功能，在各種生命活動(dòng)中都有舉足輕重的作用，如細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、基因轉(zhuǎn)錄等。要想從整體水平上明確相關(guān)疾病的發(fā)展，就要開(kāi)展對(duì)于O-GlcNAc修飾的規(guī)?；芯?。然而目前O-GlcNAc糖基化修飾的規(guī)模化鑒定面臨以下主要困難:(1)O-GlcNAc修飾含量極低;(2)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)O-GlcNAc修飾肽段信號(hào)被大量的非修飾肽段抑

2、制;(3) O-GlcNAc修飾容易發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，在樣品制備時(shí)很容易從蛋白質(zhì)上脫落;(4)O-GlcNAc修飾肽段親水性較強(qiáng)并且自身不帶電荷，因而導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)差并且在二級(jí)碎裂時(shí)極易產(chǎn)生中性丟失，難以獲得高質(zhì)量的二級(jí)譜圖。因此，為了提高O-GlcNAc修飾在蛋白質(zhì)鑒定中的規(guī)模，急需發(fā)展一系列O-GlcNAc糖基化修飾的高效、快速富集及檢測(cè)方式。這對(duì)于揭示蛋白糖基化在生理、病理過(guò)程中的重要作用都具有十分重要的意義。
　　N-異丙基

3、丙烯酰胺(N-Isopropyl acrylamide，NIPA)是目前為止性能最穩(wěn)定、使用最廣泛的溫度敏感型聚合物單體。當(dāng)環(huán)境溫度較低，沒(méi)有到達(dá)最低共溶溫度(Lower CriticalSolution Temperature，LCST)時(shí)，聚合物在水溶液中以線性分子的分散狀態(tài)存在，溶液呈澄清透明狀態(tài);當(dāng)環(huán)境溫度到達(dá)或高于相轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，聚合物自發(fā)卷曲，疏水基團(tuán)暴露在外側(cè)，從而逐漸從水溶液以沉淀形式析出，達(dá)到非均相的狀態(tài)。以該聚合物作為

4、富集基質(zhì)，通過(guò)改變不同溫度條件，可以實(shí)現(xiàn)均相分散與異相沉淀的快速轉(zhuǎn)化，應(yīng)用于低豐度蛋白/肽段的富集。采用該可溶性聚合物載體在均相體系中進(jìn)行富集反應(yīng)，可有效避免使用常規(guī)固相載體材料富集時(shí)較高的固-液界面?zhèn)髻|(zhì)阻力，以及載體材料-目標(biāo)分子間較大的空間位阻。在顯著提高富集速率、效率的同時(shí)又可利用溫敏聚合物在高溫下沉淀析出的特性，快速、高效地完成復(fù)雜樣品中目標(biāo)產(chǎn)物的分離與回收。
　　論文第一章綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀、糖基化蛋白質(zhì)的研究以及

5、基于生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于O-GlcNAc糖蛋白的規(guī)模化鑒定;O-GlcNAc糖蛋白常用的富集方法主要有凝集素富集法、抗體富集法、代謝標(biāo)簽富集法、化學(xué)酶促標(biāo)記富集法、β-消除-邁克爾加成富集法、酰肼富集法等;溫度敏感型聚合物簡(jiǎn)單介紹、常用條件以及施陶丁格反應(yīng)的原理及應(yīng)用。
　　論文第二章制備了施陶丁格試劑修飾的瓊脂糖凝膠，并基于施陶丁格基團(tuán)與疊氮的特異性反應(yīng)，將其應(yīng)用于疊氮標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)O-GlcNAc修飾蛋白的富集研究。實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)化了材料

6、制備時(shí)施陶丁格基團(tuán)的固載量及富集材料的使用量，并進(jìn)一步通過(guò)對(duì)牛血清白蛋白與疊氮標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)O-GlcNAc修飾蛋白混合物的富集，考察了該材料富集的選擇性與特異性。結(jié)果顯示該材料可以特異性富集疊氮標(biāo)記的O-GlcNAc修飾蛋白。
　　論文第三章研究了溫度敏感型線性聚合物的制備及其在蛋白質(zhì)分離富集中的應(yīng)用。在引發(fā)劑過(guò)硫酸鉀(Potassium persulfate)的引發(fā)下，N-異丙基丙烯酰胺與丙烯酸甲酯(Methyl Acrylate

7、)發(fā)生自由基聚合反應(yīng)，生成含有酯基的線性共聚物;再利用水合肼將含有酯基的聚合物酰肼化，從而在聚合物側(cè)鏈末端共價(jià)修飾酰肼基團(tuán)，得到的酰肼化的溫敏聚合物繼續(xù)與2-（二苯基膦）對(duì)苯二甲酸1-甲基4-五氟苯基二酯(2-(Diphenylphosphino)terephthalic acid1-methyl4-pentafluorophenyl diester,phosphine-PFP ester)發(fā)生反應(yīng)，合成出側(cè)鏈修飾有大量施陶丁格基團(tuán)的溫